HVEM(Herpesvirus-entry mediator)是至今发现的唯一一个既能与肿瘤坏死因子超家族成员LIGHT结合,同时也与免疫球蛋白家族成员BTLA结合的共刺激分子,被称为是调节机体免疫应答的分子开关。HVEM是单纯疱疹病毒侵入机体的媒介,是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族中的一员。HVEN既是TNF家族成员LIGHT及LTα的受体,又是单纯疱疹病毒gD糖蛋白(HSV1-gD)、LTα3、BTLA和CD160分子的配体。HVEM既能与LIGHT、LTα3结合产生正性刺激信号促进T细胞的活化与增殖,也能通过与BTLA、CD160的结合产生负性信号从而抑制T细胞活化与增殖。因此,HVEM充当了一个能同时介导正性和负性信号的角色。HVEM与TNFR/TNF超家族和CD28/B7超家族成员之间的交叉作用形成的微观网络跨越了共刺激分子家族内部的相互作用,将共刺激信号和共抑制信号协调地联系在了一起,形成了一个对T细胞免疫应答的调控网络。随着对HVEM功能不断地深入研究,HVEM在细胞和体液免疫中参与调节免疫应答的作用越来越重要。将来可能被广泛应用到自身免疫性疾病、移植排斥、心脑血管疾病及恶性肿瘤等多个临床领域。由此可见,分析和揭示其对免疫应答的调控作用有重要的生物学意义。本研究旨在通过克隆人HVEM基因,建立基因转染细胞株作为免疫原免疫小鼠,研制获得鼠抗人HVEM单克隆抗体,并以表达人HVEM分子的基因转染细胞和鼠抗人HVEM单抗为手段,研究揭示人HVEM分子的生物学特性及其对T细胞增殖作用的效应与方式。一、人HVEM基因的克隆、基因转染细胞株的建立及其生物学功能的初步研究【目的】通过克隆人HVEM编码区全长基因,建立能稳定表达人HVEM分子的基因转染细胞株,为研制鼠抗人HVEM单克隆抗体提供免疫原;并初步探讨基因转染细胞在体外对T细胞活化与增殖的影响。【方法】从此前已插入人HVEM编码区全长基因的pMD18-T/HVEM中用PCR法扩增出目的片段,经EcoR I和BamH I双酶切后插入pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建成pIRES2-EGFP/HVEM重组载体,脂质体法以重组载体pIRES2-EGFP/HVEM转染鼠L929细胞。经G418长期加压筛选获得基因转染细胞。免疫荧光标记和流式细胞术分析HVEM分子在基因转染的L929细胞膜上的表达;通过MTT法和酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定获得的基因转染细胞L929/HVEM体外对T淋巴细胞增殖及细胞因子分泌的影响。【结果】测序结果表明,获得了HVEM编码区全长基因,针对HVEM全长基因构建的重组载体经双酶切后,能够释放出852bp左右的目的基因片段,DNA测序进一步证明插入载体中的基因片段与HVEM序列完全一致;流式细胞术检测基因转染细胞株L929/HVEM细胞膜上能稳定高表达人HVEM分子。L929/HVEM和T细胞体体外细胞共培养试验表明,与未转染HVEM基因的L929/mock细胞相比,L929/HVEM能显著地促进抗人CD3单抗(mAb)刺激的T细胞增殖,以及促进T细胞对IL-2、IFN-γ、IL-10和TNF-α的分泌。【结论】成功建立了可稳定高表达人HVEM基因转染细胞,为研制抗人HVEM隆抗体提供了有效的免疫原。基因转染细胞L929/HVEM在体外能一定程度地促进抗人CD3单抗刺激的T细胞活化与增殖,并影响细胞因子的分泌。二、鼠抗人HVEM单克隆抗体的研制及生物学特性鉴定【目的】研制鼠抗人HVEM单克隆抗体为探讨人HVEM的分子特性及其介导的正性号对人T淋巴细胞促进作用的效应与方式提供必备的物质手段。【方法】以高表达人HVEM基因转染细胞L929/HVEM为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,将免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓细胞SP2/0进行细胞融合,并以基因转染细胞L929/HVEM和L929/mock流式筛选分别阳性、阴性杂交瘤克隆,经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养,获得一株特异分泌鼠抗人HVEM分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用细胞核染色体计数、Ig亚型快速定性试纸法、竞争结合抑制以及Western blot等试验,对获得的杂交瘤细胞株及单克隆抗体进行生物学特性的鉴定;用间接免疫荧光法初步分析单抗对不同来源人肿瘤细胞株的识别作用。【结果】成功获得一株稳定特异分泌鼠抗人HVEM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2B11。经体外连续培养半年以上,液氮冻存后复苏,细胞的生长状态良好,分泌抗体的性能稳定。染色体数目分析显示,杂交瘤细胞株的染色体在100条以上。杂交瘤细胞核型分析显示,杂交瘤细胞株的染色体数目在100条以上,超过小鼠B细胞和SP2/0细胞的染色体数,表明为融合体;经过快速定性试纸分析显示,单抗轻链均为κ链,重链为IgG1亚类; Western blot分析结果显示单抗2B11与HVEM-Fc融合蛋白特异性结合,形成阳性条带;采用本室建立的腹水诱生法制备单抗,腹水形成阳性率约为80%以上,腹水的收获量平均为3.5ml/只。经( NH4)2SO4盐析法纯化单克隆抗体,腹水中抗体蛋白的得率为0.5mg/ml。纯化抗体用于间接免疫荧光检测的用量为0.5~1.0μg/1x106细胞。单抗2B11与不同来源的人肿瘤细胞株作用结果表明在测定的肿瘤细胞株中,单抗检测到白血病来源的细胞株THP-1表达人HVEM分子。【结论】成功获得1株稳定分泌特异性鼠抗人HVEM单抗的杂交瘤细胞株,单抗的研制成功也为揭示HVEM的膜表达特性、深入探讨BTLA/LIGHT/HVEM共信号对T细胞的调节作用及其发挥作用的信号机制提供了必备的物质手段。总之,本论文主要开展了如下工作:克隆获得人HVEM编码区正确的全长基因,建立了基因转染细胞株L929/HVEM,初步探讨了L929/HVEM对T细胞增殖与活化的促进作用;以L929/HVEM为免疫原免疫小鼠研制获得一株特异性分泌鼠抗人HVEM单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B11;T细胞体外增殖试验表明,单抗2B11对L929/HVEM介导的促T细胞增殖与细胞因子分泌具有一定的阻断作用。鉴于HVEM在免疫排斥和自身免疫性疾病中起着重要的作用,HVEM基因转染细胞株的建立及鼠抗人HVEM单克隆抗体2B11成功研制为以后的研究工作奠定了必备的物质基础。