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目的:1.研究高毒力肺炎克雷伯菌的临床分布、耐药现状及分子流行病学特征。2.研究qnrS1质粒阳性高毒力肺炎克雷伯菌的耐药、毒力及分子流行病学特征。3.研究高毒力肺炎克雷伯菌中qnrS1质粒的适应性代价及流行传播机制。方法:1.收集南昌市某大型三甲教学医院2017年1月至2020年11月临床各种标本分离的肺炎克雷伯菌2746株作为实验菌株,并剔除同一个患者相同部位的重复菌株。应用Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定分析系统进行菌株鉴定和药敏试验,纸片扩散法补充头孢他啶/阿维巴坦药敏结果。通过医院LIS系统收集感染患者基本临床资料。使用PCR技术筛选菌株的毒力基因(rmpA、rmpA2、iutA、silS、mrkD、treW),荚膜血清型基因(K1、K2、K5、K20、K54、K57、K64)和耐药基因(blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48、qnrS1、qnrA、qnrB、blaSHV-1、blaTEM-1、blaCXT-M),将rmp A,rmp A2基因均阳性定义为高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP),再将qnrS1基因阳性定义为qnrS1-hvKP。利用Graphpad prism9软件进行数据展示及分析。2.使用PCR技术检测qnrS1-hvKP耐药基因、毒力基因及质粒复制子分型,多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析qnrS1-hvKP亲缘关系,联合高黏液表型试验、血清抗性试验、生物膜体外形成试验和大蜡螟感染模型试验分析qnrS1-hvKP毒力表型,通过接合试验、S1-PFGE、Southern blot及药敏试验分析qnrS1质粒传播特征。3.通过体外竞争试验、生长曲线试验、质粒稳定性试验分析qnrS1质粒接合子的适应性代价,对表现适应性优势的接合供体菌NUHL30457进行全基因组测序(WGS),明确其质粒基因组特征,并与Gen Bank上已测序上传的质粒进行遗传关系比较。结果:1.本研究2017-2020年收集的2746株肺炎克雷伯菌中,hvKP的检出率为27.2%,2017~2020年的检出率分别为20.9%、29.2%、25.1%、29.1%。感染患者平均年龄为56.5±15.1岁,男女比例接近2:1(66.0%:34.0%),主要来自ICU科室(48.2%)。标本主要来源于痰液(57.6%),其次为血液(13.8%)和尿液(9.7%)。除氨基糖苷类、头孢他啶/阿维巴坦和替加环素外,hvKP展现较高的抗菌药物耐药率(>30.0%),且耐药率逐年上升。碳青霉烯类、氟喹诺酮类、β-内酰胺类抗菌药物的主要耐药基因分别为blaKPC(39.6%)、qnrS1(52.0%)、blaSHV-1(30.0%)及blaTEM-1(25.0%)。Hv KP的荚膜血清分型主要为K64(34.6%),其次为K1(24.3%)、K2(11.3%)。全部hvKP中,76.2%具有高黏液表型,60.2%同时携带mrkD、iutA、silS、terW毒力基因。2.共筛选出165株qnrS1-hvKP,以ST11型为主(73.9%),且荚膜血清分型检测均为K64型,PFGE显示同源性>80.0%。ST11组菌株对19种抗菌药物耐药率均大于非ST11组,且除头孢他啶/阿维巴坦和替加环素外均具有统计学意义(P<0.05)。165株qnrS1-hvKP中,FIB、ColE、FrepB、IncR、FII质粒复制子的检出率较高,分别为98.8%、82.4%、73.9%、73.3%、62.4%,FIB+FrepB+FII+InR+ColE是最主要的复制子组合,构成比为57.0%。所有qnrS1-hvKP携带多种毒力基因,其血清抗性、生物膜形成和大蜡螟感染致死能力不一。一共9株qnrS1质粒成功接合到J53菌株中,且接合质粒大小不一,位于54.7~244.4kb之间,最常见的共传播耐药基因为blaTEM-1(77.8%)和qepA(55.6%)。3.9株qnrS1质粒接合子的适应性代价存在差异,其中4株RF值>1,表现适应性优势,2株RF值接近0.5,表现中等水平适应性代价,3株RF值<0.1,表现巨大的适应性代价。对适应性优势最明显的接合子J53-7进一步分析,可见其共竞争培养优势逐渐扩大,在含有1/2 MIC值环丙沙星的肉汤环境中质粒稳定性最好,传代至21天时质粒携带率为95.4%,但生长速率相比J53有所下降(P<0.0001)。J53-7的供体菌KP7(之后命名为NUHL30457)全基因组测序分析可见,NUHL30457含有1条5302595bp的染色体、1条215697bp的毒力质粒和3条耐药质粒,接合的qnrS1质粒p2分子量大小为126149bp。质粒p2与Gen Bank上已上传的部分耐药质粒具有高度同源性,质粒圈图分析表明p2含有ccdA-ccdB系统、SOS抑制蛋白系统、IS插入元件和大片段接合转移系统。结论:1.该院hvKP呈现较高的检出率和抗菌药物耐药率,以K64、K1、K2为主,blaKPC、qnrS1、blaSHV-1及blaTEM-1为主要耐药机制。2.该院qnrS1-hvKP的检出率较高,显示克隆传播特征,且ST11型菌株均表现多药耐药,对这类菌我们应当持续监控并采取措施,防止其进一步播散。3.不同qnrS1质粒的适应性代价不一,有抗环境有利于其生存。ccdA-ccdB系统、SOS抑制蛋白系统、IS插入元件和大片段接合转移系统的存在可能有利于质粒的转移及生存。加强对以上系统的研究并采取相关措施有利于减缓耐药质粒在相同或不同菌株之间的传播。