论文部分内容阅读
猪胎儿的发育依赖于母体营养供给,母体和胎儿之间的物质运输是通过胎盘进行的。影响母体和胎儿之间物质运输的因素主要有胎盘表面血管的密度和通透性以及胎盘面积。胎盘表面血管的生长及其调控与多种细胞因子有关。血管内皮生长因子(VEGF)是一个主要的促进血管生长、舒张和增加血管通透性的调节子。VEGF基因的表达增加能够激活其酪氨酸激酶受体VEGFR1和VEGFR2,诱导VEGFR信号转导通路的下游目标基因内皮一氧化氮合酶(eNOS)和血管内皮钙粘蛋白(CDH5)活性,促进血管内皮细胞的增殖和增加血管通透性。本研究以人、鼠和牛的VEGF,VEGFR1,VEGFR2,eNOS,iNOS,ARRB2,CDH5基因为基础,通过比较基因组学和生物信息学等方法克隆了猪VEGF,VEGFR1,VEGFR2,eNOS,iNOS,ARRB2,CDH5基因的部分cDNA序列;采用RT-PCR和荧光定量PCR方法研究了这7个基因的组织表达和时空表达规律;并且以大白猪为研究对象,采用测序和PCR-RFLP等方法检测iNOS基因的多态性及其与生产和繁殖性状的关系。主要研究结果如下:1.采用同源克隆和电子克隆相结合的方法克隆了猪VEGF,VEGFR1,VEGFR2,eNOS,iNOS,ARRB2,CDH5基因部分cDNA序列,提交NCBI获得收录号EU714324,EU714325,EU714326,EU714327,EU274294,EU714330,EU714329,推导出的氨基酸序列与来自EMBL和GenBank数据库的其他物种蛋白序列进行比对,并用DNAMAN软件对VEGF,VEGFR1,VEGFR2,eNOS,iNOS,ARRB2,CDH5基因作了进化树分析。2.根据基因内含子区域设引物后利用辐射杂种板技术对VEGF,VEGFR1和VEGFR2基因进行了染色体定位,结果表明它们分别定位在7q11-q12、11p13以及8p12区域。上述3个基因的定位结果皆与人基因组中相应基因的染色体位置相对应。3.利用RT-PCR方法检测了VEGF,VEGFR1,VEGFR2,eNOS,iNOS,ARRB2,CDH5基因在长白猪90d胚胎的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、胎盘七个组织的表达水平,结果表明VEGF,VEGFR1,VEGFR2,eNOS,iNOS,ARRB2,CDH5基因在长白猪90d胚胎的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、胎盘七个组织中均广泛表达。4.利用实时荧光定量PCR方法检测了VEGF,VEGFR1,VEGFR2,eNOS,iNOS、CDH5和ARRB2基因在不同妊娠时期和不同品种猪胎盘中的表达水平差异。结果表明VEGF和ARRB2基因在长白猪妊娠33d到90d胎盘表达趋势上调(p＜0.05);VEGF,VEGFR1,VEGFR2和eNOS基因在二花脸妊娠90d胎盘中表达水平与在长白猪妊娠90d胎盘的表达相比均显著升高(p＜0.01),CDH5和ARRB2基因表达水平在二花脸妊娠90d胎盘中与在长白猪妊娠90d胎盘的表达相比显著降低(p＜0.01)。5.发现在猪iNOS基因编码区中存在一个A/C的碱基突变位点导致编码氨基酸由谷氨酸变为丙氨酸,利用PCR-Bsh1236Ⅰ-RFLP方法在295头大白猪中进行相关分析表明该突变位点与全程日增重有显著相关(p＜0.05)。