小鼠巨噬细胞S100A9/NF-κB/SAA3/mir-204环路在炎症相关性结肠癌发展中的作用

来源 :中南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xujinjinjin
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非可控性炎症与肿瘤发生、发展以及侵袭转移密切相关。结肠癌发病率在国内、外均呈上升趋势,全世界每年大约有655,000人死于结直肠癌,严重威胁着人类健康。非可控性结肠炎相关结直肠癌虽与经典腺瘤性结直肠癌相似,但其从发病伊始即有明确的炎症因素影响,在发病机制上与后者有着较大的差异。目前非可控性结肠炎相关结直肠癌发病机制的研究仍处于起步阶段。前期研究中,我们利用非可控性结肠炎相关结直肠癌小鼠模型对“炎症-不典型增生-癌症”序列演进过程中的动态转录组学进行了研究,构建了“炎-癌”进展过程调控网络图,并通过生物信息学方法筛选了其中关键的节点及主要信号通路。我们注意到可溶性分子SAA3、S100A8和S100A9在“炎-癌”演进全过程持续升高,NF-κB、MAPK、Wnt/β-catenin通路在浸润的炎性细胞及恶性转化的上皮细胞中存在阶段性活化,提示炎症微环境在结肠癌发生发展过程中发挥重要作用。  在本课题研究中我们重复了AOM/DSS小鼠模型,并进一步利用qRT-PCR、ELISA、免疫组化研究了SAA3、S100A8和S100A9在“炎-癌”演进过程中的表达,发现三个分子均首先在炎性细胞中高表达。就表达趋势而言,SAA3在炎症早期及癌变期高表达;S100A8在炎症及癌症起始阶段高表达;S100A9在正常细胞中无明显表达,受到刺激后表达水平持续升高。提示这三个分子在炎症促进肿瘤发生发展的过程中均发挥着一定作用。进一步我们以巨噬细胞为炎症微环境的代表,分别应用S100A8和S100A9重组蛋白刺激小鼠巨噬细胞后可以激活细胞中PI3K/AKT和NF-κB信号通路,并明显上调其内SAA3的表达。采用通路阻断策略分别抑制PI3K/AKT、NF-κB以及MAPK/ERK信号通路,发现当PI3K/AKT和NF-κB信号通路活性被抑制后,S100A8及S100A9上调SAA3的作用被抑制,而抑制MAPK/ERK信号通路活性后,该作用反而增强了,提示MAPK/ERK信号通路在这一过程中发挥负反馈调节作用。为明确SAA3对S100A8和S100A9表达的影响,我们通过生物信息学预测出miR-204可能靶向调控S100A9的表达。通过构建SAA3过表达载体转染巨噬细胞,发现SAA3过表达可抑制miR-204的表达,同时明显上调S100A9的表达。进而构建了包含有S100A93-UTR上miR-204潜在结合位点的突变及野生型荧光素酶报告载体,分别与miR-204过表达载体共转染293T细胞后,发现野生型荧光素酶活性明显低于突变型及对照,证实miR-204能直接靶向调控S100A9的表达。证实巨噬细胞中S100A8和S100A9通过激活PI3K/AKT及NF-κB信号通路上调SAA3表达。发过来,SAA3可通过抑制miR-204的表达而促进S100A9的表达,形成正反馈环路。  我们发现将S100A8和S100A9刺激巨噬细胞后的培养上清与小鼠结肠癌细胞共培养可以引起小鼠结肠癌细胞中SAA3的高表达。功能学实验结果显示SAA3过表达可促进结肠癌细胞增殖、促进其侵袭转移,并增强其对奥沙利铂的耐药性。细胞免疫荧光及westernblot结果均证实SAA3过表达可促进β-catenin入核。进一步实验发现,SAA3高表达细胞系中p-ERK、CCND2、MMP9和BCL-2的表达上调而GSK3β表达下调。使用β-catenin干扰质粒及MAPK信号通路抑制剂PD98059分别沉默β-catenin在SAA3过表达细胞株中的表达以及阻断MAPK信号通路活性后发现结肠癌细胞侵袭转移能力及对奥沙利铂的耐药性均降低,下游分子p-ERK、MMP9、CCND2和BCL-2的表达下调。利用GSK3β过表达载体恢复其在SAA3过表达细胞里的水平,得到同样的结果。提示SAA3可通过活化MAPK/ERK信号通路,降低GSK3β的表达,促进β-catenin入核,上调CCND2、MMP9和BCL-2的表达,发挥促进结肠癌细胞增殖及侵袭转移能力,抑制凋亡。  综上所述,在肿瘤相关炎症微环境(以巨噬细胞为主)中,S100A8和S100A9通过激活PI3K/AKT及NF-κB信号通路上调SAA3表达。SAA3可通过下调miR-204的表达而上调S100A9的表达,形成正反馈环路,使SAA3、S100A8和S100A9在“炎-癌”序列演进过程中始终维持高表达。而MAPK/ERK信号通路的活化可以抑制S100A8和S100A9诱导的SAA3升高,发挥负反馈调节作用。炎症微环境促使结肠癌细胞中SAA3表达升高。SAA3通过激活MAPK信号通路引起ERK磷酸化,活化的ERK与GSK3β相结合而抑制其表达,继而促进β-catenin入核,激活BCL-2、CCND2及MMP9的转录,促进了结肠癌细胞的增殖、侵袭能力,并降低了结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性。
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