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下腰痛（Low back pain,LBP）是引起成年人劳动力丧失甚至致残的重要原因,给个人造成严重的经济负担和精神障碍。椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IVDD）是LBP的最主要原因。髓核细胞（nucleus pulposus cells,NPCs）数目减少或功能减退是发生IVDD的重要特征,研究NPCs减少和功能丧失的机制对于寻找治疗IVDD的潜在靶点十分重要。在IVDD进程中,髓核组织会发生明显的炎性环境改变,IL-1β等炎症因子的增多会导致NPCs变性甚至死亡,加速IVDD进展。细胞焦亡（pyroptosis）和NLRP3炎症小体参与了IVDD进程,但在NPCs内,其相关活化途径和抑制机制仍不清楚。线粒体自噬（mitophagy）是清除损伤的线粒体、维持细胞稳态的重要途径,但在NPCs内,线粒体自噬与细胞焦亡的关系目前尚未见报道。SIRT1在抗炎、线粒体稳态维持等方面有重要作用,但在IVDD进程中,SIRT1对细胞焦亡的调控作用目前未见报道。SRT1720是SIRT1的选择性激动剂,在椎间盘领域,能否延缓IVDD进展,其体内作用目前尚未得到验证。本课题拟从IL-1β通过线粒体途径诱导人髓核细胞焦亡的发生;SIRT1通过促进线粒体自噬缓解IL-1β诱导的髓核细胞焦亡;SRT1720通过抑制细胞焦亡缓解大鼠椎间盘退变等三个方面,阐述SIRT1对IL-1β介导的退变髓核细胞焦亡的影响和机制研究。第一部分IL-1β通过线粒体途径诱导人髓核细胞焦亡的发生目的:探讨IL-1β是否可以通过线粒体途径诱导人髓核细胞焦亡的发生。方法:根据纳入和排除标准,收集相对正常组和退变组的人髓核组织,通过HE染色和免疫组化,分别观察其组织结构和NLRP3炎症小体表达情况。体外提取和培养人髓核细胞,不同浓度（10,20,50,100 ng/ml）的IL-1β干预后,CCK-8检测NPCs活力,WB检测细胞焦亡相关指标表达情况。结合Hoechst33342/PI染色和扫描电镜观察,确认是否有细胞焦亡发生。同时在IL-1β干预后,利用JC-1染色、Mito SOX染色、DCFH-DA染色和透射电镜检测NPCs线粒体功能和形态变化。Mito-Tempo抑制线粒体活性氧后,WB检测NLRP3炎症小体和细胞焦亡相关指标蛋白表达情况,并结合Hoechst33342/PI染色评估发生细胞焦亡的髓核细胞比例变化。结果:HE染色显示退变髓核组织中髓核细胞减少,细胞外基质成分丢失,免疫组化显示NLRP3和IL-1β阳性细胞比例显著增加。CCK-8结果表明,不同浓度的IL-1β干预均会导致NPCs活力降低;当IL-1β超过50ng/ml时,WB显示NPCs中NLRP3、ASC、p20蛋白表达均显著增加;同时,PI阳性细胞比例显著增加。扫描电镜发现,IL-1β处理使髓核细胞膜出现较多的孔洞形成和球状突起。在IL-1β干预后,NPCs出现了线粒体膜电位显著降低,线粒体活性氧水平和细胞总体活性氧水平显著增加;线粒体出现肿胀,嵴断裂等损伤形态。使用Mito-Tempo抑制线粒体活性氧后,WB检测发现NLRP3、ASC、p20、GSDMD-N和Cleaved IL-1β等蛋白表达均显著降低,Hoechst33342/PI染色显示PI阳性细胞比例显著降低。结论:IL-1β通过线粒体途径诱导人髓核细胞焦亡的发生。第二部分SIRT1通过促进线粒体自噬缓解IL-1β诱导的髓核细胞焦亡目的:探讨SIRT1和线粒体自噬在IL-1β诱导的髓核细胞焦亡中的作用。方法:利用慢病毒转染使人NPCs中SIRT1过表达后,WB检测线粒体自噬相关蛋白表达水平;利用GFP-LC3腺病毒转染和Mito-Tracker探针处理NPCs后,观察自噬体与线粒体共定位情况。同时,使用JC-1染色与Mito SOX荧光染色分别检测线粒体膜电位（ΔΨm）变化与线粒体活性氧水平变化。WB和免疫荧光检测细胞焦亡相关蛋白表达情况,Hoechst33342/PI染色检测发生细胞焦亡的NPCs比例变化情况。结果:SIRT1过表达后,WB检测发现PINK1、Parkin、LC3蛋白表达显著增加,p62表达显著降低。在IL-1β+LV-SIRT1组,激光共聚焦显微镜观察到代表自噬体的绿色颗粒与代表线粒体的红色颗粒的共定位显著增加,JC-1染色结果显示ΔΨm显著提高,Mito SOX荧光探针染色表明线粒体活性氧水平显著降低,NLRP3、ASC、p20、GSDMD-N和Cleaved IL-1β的蛋白表达水平显著降低;Hoechst33342/PI染色显示PI阳性细胞比例显著降低,说明SIRT1过表达抑制了NPCs中NLRP3炎症小体的活化和细胞焦亡。而在IL-1β+LV-SIRT1+3-MA组,NLRP3、ASC、p20、GSDMD-N和Cleaved IL-1β的蛋白表达水平显著增加,Hoechst33342/PI染色表明PI阳性细胞比例显著增加,说明自噬水平受到抑制后,SIRT1的保护作用也被减弱。结论:SIRT1通过促进线粒体自噬缓解IL-1β诱导的髓核细胞焦亡。第三部分SRT1720通过抑制细胞焦亡缓解大鼠椎间盘退变目的:体内研究SIRT1选择性激动剂SRT1720对大鼠椎间盘退变的作用。方法:通过针刺纤维环法构建大鼠尾椎间盘退变模型,SD大鼠随机分为4组:Sham组、Puncture组、Vehicle组和SRT组。Sham组不穿刺椎间盘,仅分离和缝合皮下组织;Puncture组穿刺椎间盘后缝合切口;Vehicle组穿刺椎间盘后,向穿刺间隙注入10μl DMSO;SRT组穿刺椎间盘后,向穿刺间隙注入10μl SRT1720。在术后第4周和第8周时,通过MRI检查和Pfirrmann分级,评价各组椎间盘影像学退变程度。在第8周时,通过HE染色和番红O-固绿染色评价各组椎间盘组织学退变程度;采用免疫组化检测各组髓核组织中细胞焦亡及自噬相关蛋白水平变化。结果:MRI和Pfirrmann分级结果显示,术后第4周和第8周时,Puncture组和Vehicle组的椎间盘退变程度较Sham组显著增加;在SRT组,椎间盘T2像信号和Pfirrmann分级较Puncture组和Vehicle组有明显改善。HE和番红O-固绿染色显示,相较于Sham组,Puncture组和Vehicle组有较多的椎间盘结构破坏,髓核组织明显减少;SRT组的椎间盘破坏程度较Puncture组和Vehicle组有所缓解,蛋白多糖等基质成分有明显恢复。免疫组化显示,Puncture组和Vehicle组的NLRP3、p20和IL-1β阳性细胞比例显著增加,LC3表达呈低水平;在SRT组,NLRP3、p20和IL-1β表达显著降低,PINK1和LC3阳性细胞比例显著增加。结论:SRT1720通过抑制细胞焦亡缓解大鼠椎间盘退变。