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目的:本实验旨在利用Solexa测序技术在全基因范围内筛选可以用来预测脓毒症预后的血清miRNAs,并利用生物信息学软件预测新的miRNAs。
方法:收录2009年9月15日到2010年11月20日在中国人民解放军总医院呼吸重症监护病房、急诊重症监护病房和外科重症监护病房住院患者,满足脓毒症两项及两项以上条件的感染患者94例。按照28天病死率,生存患者51例,死亡患者43例,并以24名健康人血清作为对照。采集第1天的血清,并记录对应时间的生命体征、CRP、PCT、血常规、生化、凝血及动脉血气。然后,选取生存患者与死亡患者各9例,组成两个血清池行solexa测序分析。利用qRT-PCR验证测序筛选的差异表达的miRNAs,对有差异的miRNAs进行ROC曲线分析,比较AUC面积。最后将上述筛选的miRNAs和常用指标包括CRP,PCT,APECHE II评分和SOFA评分均纳入二分类变量logistic回归分析,筛选同脓毒症预后相关的因素。对最终筛选的miRNAs进行靶基因预测与KEGG通路注释,预测其参与脓毒症发病的机制。另外,利用生物信息学软件预测新的miRNAs。
结果:经过Solexa测序后筛选出12种差异表达的miRNAs,选取同脓毒症相关的6种miRNAs(miR-206,miR-378,miR-223,miR-15b,miR-15a,miR-16)进行qRT-PCR验证。验证后本研究的主要结果如下:(1) miR-223,miR-15b和miR-16在两组之间差异有统计学意义,p值分别为0.002,0.008和0.009,并且这三种miRNAs的表达水平生存组高于正常组,死亡组低于正常组;(2)将这三种miRNAs同CRP,PCT,APECHE II评分和SOFA评分进行ROC曲线分析,比较曲线下面积结果示miR-16的AUC是0.847(95%CI,0.763-0.932),高于APECHE II评分和SOFA评分的AUC0.813(95%CI,0.721-0.906),0.807(95%CI,0.712-0.902)。miR-223的AUC是0.768(95%CI,0.661-0.874)高于CRP和PCT的曲线下面积;(3)将这三种miRNAs与脓毒症患者的性别,年龄,APECHE Il评分,SOFA评分,CRP,PCT,白细胞计数,体温和伴随疾病(高血压,糖尿病,冠心病和免疫抑制)纳入二分类变量单因素Logistic回归分析,以p<0.05作为筛选标准,三种miRNAs与APECHE II评分,SOFA评分,PCT均入选而纳入二分类变量多因素回归分析,结果示这三种miRNAs与APECHEII评分,SOFA评分进入最后的回归方程。miR-223和miR-16的OR分别是0.212(95%CI,0.062-0.734)和0.135(95%CI,0.025-0.727),说明miR-223和miR-16是脓毒症患者独立的保护因子。APECHE II评分和SOFA评分的OR分别是1.212(95%CI,1.046-1.403)和1.518(95%CI,1.083-2.127),二者是脓毒症患者预后的危险因子;(4)将这六个miRNAs的表达水平在正常组,生存组和死亡组之间进行one-way ANOVA分析示miR-15b,miR-15a和miR-16在三组间有表达差异,p值分别是0.023,0.008,和0.017。miR-15a的表达水平在生存组与死亡组均高于正常组。进一步将病例分为正常组(n-24)和脓毒症组(n=76)进行t检验,结果示miR-223与miR-15a在两组间差异有统计学意义,而miR-15a诊断脓毒症的AUC是0.853(95%CI,0.768-0.938),当miR-15a的表达水平是0.034时,miR-15a诊断脓毒症的特异性是75.0%,敏感性是86.8%。这些数据显示miR-15a是脓毒症的新的血清标记物。生物信息学分析显尔,ACVR2A和MAP2K1是这三种miRNAs预测的靶基因。
结论:
1.miR-223,miR-15b和miR-16可以用来评价脓毒症的预后,而miR-16预测脓毒症患者病死率的价值最大。
2.miR-223与miR-16是脓毒症的独立的保护因子,而APECHE II评分和SOFA评分是脓毒症患者预后的危险因子。
3.miR-15a是本研究鉴定的新的脓毒症血清标记物。
4.ACVR2A和MAP2K1是预测的miR-223,miR-15b和miR-16的靶基因。