【摘 要】
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世界范围内抗菌药物的过度使用,使其在动物机体及生存环境中大量蓄积,长期摄入可能对人体健康产生严重危害。近年来,我国对食品质量安全的监管不断深入,对动物性食品中抗菌药物残留限量的标准也更加严格。但是仍有不法商家在动物养殖中违法使用抗菌药物,企图逃避监管。因此,开发食品中抗菌药物的高灵敏快速检测方法,对于保障食品安全至关重要。传统的大型仪器检测法过度依赖大型设备和技术人员,难以满足日益增长的检测需求。
【基金项目】
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国家重点研发计划（2018YFC1602903）；
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世界范围内抗菌药物的过度使用,使其在动物机体及生存环境中大量蓄积,长期摄入可能对人体健康产生严重危害。近年来,我国对食品质量安全的监管不断深入,对动物性食品中抗菌药物残留限量的标准也更加严格。但是仍有不法商家在动物养殖中违法使用抗菌药物,企图逃避监管。因此,开发食品中抗菌药物的高灵敏快速检测方法,对于保障食品安全至关重要。传统的大型仪器检测法过度依赖大型设备和技术人员,难以满足日益增长的检测需求。免疫学检测方法具有高灵敏度高特异性的优势,在抗菌药物的检测中起着重要作用。然而,抗菌药物本身作为半抗原,其偶联载体蛋白合成完全抗原的过程非常复杂且产物稳定性较低。针对以上不足,本研究以氟喹诺酮类抗菌药诺氟沙星作为典型代表,创新性地采用产率高、产物稳定性高,且具有模块化特点的点击化学合成方法进行半抗原改造,用傅里叶变换红外光谱、质谱和免疫学方法对其分子量和免疫学活性进行了验证,并依托免疫学分析技术建立了两种检测方法。具体研究内容如下:（1）基于点击化学合成方法的诺氟沙星模块化检测体系的构建。通过氨基与羧基的缩合反应在诺氟沙星的羧基端修饰叠氮基团,合成了诺氟沙星-叠氮偶联物,利用点击化学（叠氮-炔基环加成反应）将其与炔基修饰的生物素以及炔基修饰的等温扩增引物偶联,实现了诺氟沙星-生物素以及诺氟沙星修饰引物的合成。通过使用纳米材料负载生物酶,催化底物进行信号放大,开发了诺氟沙星高灵敏免疫学检测方法;通过核酸等温扩增的信号放大手段,开发了灵敏且快速的免疫学与等温扩增技术相结合的诺氟沙星检测方法。（2）基于点击化学的牛奶中诺氟沙星高灵敏双信号检测技术研究。本章建立了一种直接竞争免疫分析方法,实现了牛奶中诺氟沙星残留的化学发光/荧光双信号检测。首先通过点击化学合成方法制备了诺氟沙星-生物素双功能缀合物。检测过程中,诺氟沙星-生物素与游离诺氟沙星竞争固相抗体,通过生物素-亲和素系统,固定在抗体上的诺氟沙星-生物素,特异性地与链霉亲和素-碱性磷酸酶标记的量子点微球相结合,通过量子点大的比表面积负载大量碱性磷酸酶而进行信号放大,从而实现化学发光和荧光双信号的高灵敏输出。两种输出信号（化学发光和荧光）检测限分别达到3.40 pg/m L和8.80 pg/m L,线性范围为0.013～12.48 ng/m L和0.042～39.87 ng/m L,特异性较好,能够区分不同类型的抗菌药。加标回收试验表明,该检测方法能够有效检测牛奶中的诺氟沙星。同时,与文献报道的其他方法相比,本方法具有一定的高灵敏度的优势。（3）基于点击化学和抗体控制等温扩增反应的诺氟沙星快速检测技术研究。本章的创新性在于将免疫学检测方法与等温扩增技术相结合,构建了一种新型的诺氟沙星生物传感器。利用点击化学反应将诺氟沙星修饰于等温扩增引物3’末端特定位点,引物末端含有切刻内切酶Nt.Bsm AI的特异性识别序列。当样品中不含诺氟沙星时,抗体与引物末端修饰的诺氟沙星特异性结合,由于其空间位阻作用,阻遏了切刻内切酶Nt.Bsm AI的识别和切刻,DNA双链不产生缺口,DNA聚合酶Klenow Fragment无法催化新链的合成,从而阻止了SDA反应;反之,样品中游离的诺氟沙星与引物末端修饰的诺氟沙星竞争结合抗体,导致抗体从引物链上解离释放,此时,切刻内切酶Nt.Bsm AI与其特异性识别位点顺利结合并进行切刻,具有链置换活性的DNA聚合酶Klenow Fragment催化新链的合成,从而引发SDA循环。SDA反应产生的富G序列可折叠成G-四链体,与荧光染料硫黄素T结合,导致其荧光信号增强。所构建的传感器线性范围为0.1～500 ng/m L,检测限为0.04 ng/m L（S/N=3）,特异性好,能够区分其他类型的常用抗菌药,有效地检测食品、环境和生物样本中的诺氟沙星。该检测体系冷冻干燥后在4℃保存稳定性较高,仅需两个小时就能够实现样本中诺氟沙星的检测,具有现场快速检测的潜力。本研究基于点击反应的模块化特点,将叠氮基团修饰诺氟沙星,炔基分别修饰生物素和DNA,建立了两种诺氟沙星检测体系,对诺氟沙星均具有较高的响应性,实现了诺氟沙星的高灵敏和快速检测,为小分子的高灵敏、模块化检测提供了新的思路,具有一定的应用前景。
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