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程序性死亡配体-1(PD-L1)是B7/CD28协同刺激因子超家族的重要成员,PD-L1与其受体PD-1相互作用可抑制T细胞的活化增殖和细胞因子的分泌,负调控免疫应答,并在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。本实验目的在于构建人PD-L1转基因细胞,从而研究PD-L1信号对肺癌局部微环境胸水中CD8+T细胞的生物学功能的调节作用,初步探讨PD-1/PD-L1途径在肺癌免疫逃逸中的作用。第一部分PD-1分子在肺癌恶性胸水中CD8+T细胞上的表达目的:观察肺癌恶性胸水中CD8+T细胞上PD-1分子的表达。方法:本研究收集了21例初诊肺癌患者的恶性胸水,Ficoll密度梯度离心法分离胸水得到单个核细胞,利用CD8抗体圈门流式细胞技术检测肺癌恶性胸水CD8+T细胞上PD-1表达。结果:肺癌恶性胸水中CD8+T细胞不同程度表达PD-1分子,表达水平为12.30±7.72%,21例病例中有11例表达高于中位表达水平(≥9.2%)。Fisher检验分析显示PD-1表达与患者性别、年龄、吸烟状况以及病理类型均无相关性(P>0.05)。结论:肺癌恶性胸水中CD8+T细胞表达PD-1分子,提示CD8+T细胞表达的PD-1分子可能通过与肿瘤细胞上的PD-L1相互作用而抑制CD8+T细胞的功能。第二部分人PD-L1真核表达载体的构建及稳定高表达的基因转染细胞系HEK293/PD-L1的建立目的:构建含有人PD-L1基因的真核表达载体,并通过稳定转染获得稳定表达PD-L1分子的HEK293细胞系,为研究PD-L1信号对肺癌恶性胸水中CD8+T细胞生物学功能的调节作用打下实验基础。方法:采用PCR方法从人心脏cDNA文库中扩增出PD-L1基因并测序正确,通过双酶切(Xho1和EcoR1)装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定高表达PD-L1分子的HEK293细胞系,通过流式细胞术(FCM)、RT-PCR及Western-blot分析PD-L1的表达。结果:成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP/PD-L1,并建立稳定转染PD-L1目的基因的HEK293细胞系。FCM分析结果表明,载体中携带的绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)在细胞中获得99%的高表达。用鼠抗人PD-L1直标单抗检测显示,人PD-L1蛋白在HEK293/PD-L1转基因细胞膜表面存在高表达(≥90%)。RT-PCR检测能扩增出特异性目的基因,表明该重组载体已经较好地整合进真核细胞的基因组中。Western-blot分析结果显示抗PD-L1单抗能与PD-L1分子特异性结合,形成特异性阳性条带。结论:成功构建PD-L1真核表达载体,并获得了稳定转染该基因的HEK293/PD-L1细胞系第三部分PD-L1信号对肺癌恶性胸水中CD8+T细胞生物学功能的调节作用目的:探讨PD-L1信号对肺癌恶性胸水CD8+T细胞生物学功能的调节作用。方法:无菌收集新鲜肺癌恶性胸水,Ficoll密度梯度离心法初步分离胸水得到单个核细胞,再用磁珠分离阳性选择得到CD8+T细胞。采用PHA刺激CD8+T细胞,分别加入HEK293/PD-L1转基因细胞及HEK293/mock细胞混合培养,分为两组,即实验组:CD8+T+HEK293/PD-L1+PHA,对照组:CD8+T+HEK293/mock+PHA。流式细胞术分析CD8+T细胞表型及细胞凋亡,MTT法观察CD8+T细胞的增殖效应,ELISA法检测CD8+T细胞分泌IFN-γ的水平。结果:选择1:10为刺激细胞/效应细胞比,与对照组相比,PD-L1转基因细胞刺激组CD8+T细胞的增殖受抑制[(0.337±0.022) vs (0.229±0.018),P<0.05],IFN-γ的分泌水平有显著下降([355.3±28.6)pg/ml vs (106.2±17.5)pg/ml,P<0.01]。同时,与对照组相比,PD-L1转基因细胞刺激组CD8+T细胞的活化表型CD25的表达下降了20%左右(P<0.01),而CD69的表达无差异(P>0.05)。取同一时相测CD8+T细胞凋亡率,PD-L1转基因细胞刺激组CD8+T细胞的凋亡与对照组相比明显增加[(10.1±3.1)% vs (21.5±2.4)%,P<0.05]。结论:PD-L1转基因细胞可显著抑制肺癌恶性胸水中CD8+T细胞的增殖及IFN-γ的分泌,并诱导CD8+T细胞发生凋亡,PD-1/PD-L1途径对肺癌恶性胸水中CD8+T细胞的功能具有显著的负性调节作用。