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目的:探究爵床抗血小板聚集的有效物质及其药效,并阐释其作用机制,为爵床药材资源的开发利用奠定基础。方法:1.爵床药材,乙醇渗漉提取得到乙醇提取液,减压回收乙醇,得到爵床浓缩提取液;大孔吸附树脂对爵床浓缩提取液进行分段纯化,小鼠尾血栓试验对各段进行筛选,确定爵床抗血小板聚集的有效物质部位(简称RPE),利用高效液相色谱法分离RPE中潜在的有效成分。2.体外抗血小板聚集作用验证试验。检测RPE及其潜在有效成分对血小板乳酸脱氢酶(LDH)释放的影响,判断其对血小板的毒性;采用比浊法,检测RPE及其潜在有效成分对凝血酶(Thrombin)、二磷酸腺苷(ADP)和胶原(Collagen)诱导的兔血小板的聚集率,证明其抗血小板聚集的作用;制备胶原包被的盖玻片,模拟正常血管暴露的胶原,在荧光显微镜下观察RPE及其潜在有效成分对血小板粘附的影响,证明其抗血小板粘附的作用。3.以肺栓塞小鼠和尾血栓大鼠整体动物模型为研究对象,灌胃给予RPE及其潜在有效成分,证明其体内抗血栓的药效。4.爵床有效物质抗血小板聚集作用机制研究方面,采用ELISA试剂盒检测尾血栓大鼠血清中P-选择素(P-selectin)、血栓素B2(TXB2)和6-酮-前环列腺素1α(6-keto-PGF1α)含量;Western Blot试验检测尾血栓大鼠血小板整合素(integrin)β3蛋白表达和血小板聚集相关信号通路Gi-PI3K-MAPKs中蛋白激酶B(Akt)、应激活化蛋白激酶(JNK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)以及p38蛋白等关键蛋白的表达。结果:1.大孔吸附树脂纯化爵床提取液,得到A组、B组、C1组和C2组4组物质。小鼠尾血栓试验筛选有效部位,确定C1组具有较好的抗小鼠尾血栓活性,为有效部位,标记为RPE。HPLC法制备RPE,得到5种潜在有效化合物,分别为6′-羟基爵床脂定B、爵床脂定B(简称JDB)、金不换甲醚(简称CME)、新爵床脂定B和新爵床脂定A,其中JDB、CME含量较大。2.RPE和JDB以及CME无明显的细胞毒性,血小板LDH释放率均在3%以下。体外抗血小板试验中,用Thrombin做诱导剂时,与Control比较,RPE高、中剂量组和JDB组有抗血小板聚集的作用(P<0.05);用ADP诱导时,RPE高、中、低剂量组以及JDB和CME组均有抗血小板聚集的作用(P<0.05);用Collagen诱导时,RPE高、中剂量组以及JDB和CME组有抗血小板聚集的作用(P<0.05)。结果表明,JDB和RPE高、中剂量对Thrombin、ADP和Collagen三种诱导剂诱导的血小板聚集均有抑制作用,CME对ADP和Collagen诱导的血小板聚集有抵抗作用。荧光显微镜观察血小板粘附的情况,RPE、CME和JDB均有抗血小板粘附的作用(P<0.05)。3.肺栓塞小鼠试验,小鼠在造模后出现抽搐并死亡,与模型组比较,RPE高、中剂量组以及JDB和CME组均能减小肺栓塞小鼠的肺系数(P<0.05),HE切片染色观察肺栓塞小鼠的肺部毛细血管,模型组小鼠的肺部血细胞形成血栓紧密堆积在血管内,而RPE高剂量组和JBD组小鼠相对正常。结果表明,RPE高剂量和JDB对小鼠肺栓塞有一定的保护作用。尾血栓大鼠试验,与模型组比较,RPE高、中、低3个剂量组以及JDB和CME组均能降低尾血栓大鼠的黑尾率(P<0.05),表明JDB、CME和RPE具有一定的体内抗血栓作用。比浊法测定各组大鼠的血小板在Thrombin、ADP和Collagen三种诱导剂诱导下的聚集率,RPE的高、中剂量组和JDB组大鼠血小板聚集率有所下降(P<0.05),RPE低剂量组与模型组无统计学差异(P>0.05),CME组仅在以ADP为诱导剂时显现出抗血小板聚集的活性(P<0.05)。表明RPE高、中剂量和JDB体内给药时,具有一定的抗血小板聚集的作用,而CME的抗血小板聚集作用不明显。4.ELISA试剂盒检测尾血栓大鼠血清中P-selectin的含量,与模型组比较,RPE高、中、低剂量组以及JDB和CME组均能缓解P-selectin的含量升高,减少血小板颗粒的释放(P<0.05)。ELISA试剂盒检测血清中TXB2的含量,与模型组比较,RPE高、中剂量组以及JDB组均能缓解TXB2的含量升高(P<0.05)。ELISA试剂盒检测血清中6-keto-PGF1α的含量,与模型组比较,RPE高、中剂量组以及JDB组均能缓解6-keto-PGF1α的含量降低(P<0.05)。Western Blot试验结果表明,与模型组比较,阿司匹林组和RPE高剂量组能显著下调integrinβ3蛋白及磷酸化Akt、磷酸化ERK、磷酸化JNK、磷酸化p38的表达(P<0.05),JDB能显著下调integrinβ3蛋白及磷酸化JNK、p38的的表达(P<0.05),RPE中、低剂量组能显著下调磷酸化ERK、磷酸化JNK的表达(P<0.05),且RPE中剂量能显著下调磷酸化p38的表达(P<0.05),CME能显著下调磷酸化Akt、磷酸化ERK的表达(P<0.05)。结论:1.体外抗血小板聚集、抗血小板粘附以及小鼠肺栓塞、大鼠尾血栓等试验表明,爵床有效物质RPE以及单体化合物JDB、CME具有确切的抗血小板聚集作用。2.爵床有效物质可通过降低尾血栓大鼠血清中P-selectin的含量、减少血小板颗粒的释放,减少血清中TXA2的生成、增加PGI2的产生,下调αⅡbβ3蛋白表达,下调Gi-PI3K-MAPKs信号通路中关键蛋白磷酸化Akt、磷酸化JNK、磷酸化ERK以及磷酸化p38的表达而达到抗血小板聚集的作用。