【摘 要】
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糖基化是蛋白质翻译后修饰的重要方式之一,具有重要的生物学功能。在众多糖基化修饰形式中,蛋白的O-岩藻糖基化已经被证实与动物胚胎发育、细胞迁移、肿瘤生长、病灶转移等重要生理活动密切相关。但在植物中,O-岩藻糖基化的相关功能研究较少,其催化关键酶即O-岩藻糖基转移酶（POFUT）尚缺乏系统的研究,并且O-岩藻糖基化修饰蛋白也未被鉴定。因此,本论文主要以拟南芥POFUT作为研究对象,先通过毕赤酵母异源表
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糖基化是蛋白质翻译后修饰的重要方式之一,具有重要的生物学功能。在众多糖基化修饰形式中,蛋白的O-岩藻糖基化已经被证实与动物胚胎发育、细胞迁移、肿瘤生长、病灶转移等重要生理活动密切相关。但在植物中,O-岩藻糖基化的相关功能研究较少,其催化关键酶即O-岩藻糖基转移酶（POFUT）尚缺乏系统的研究,并且O-岩藻糖基化修饰蛋白也未被鉴定。因此,本论文主要以拟南芥POFUT作为研究对象,先通过毕赤酵母异源表达拟南芥POFUT蛋白,测定了其体外催化活性;随后通过构建筛选At POFUT1缺失型及过表达型拟南芥突变体,明确了POFUT在植物生长发育、病害抵御、诱导子响应过程中的功能;进一步建立了O-岩藻糖基化蛋白富集和检测方法,首次鉴定了系列拟南芥O-岩藻糖基化修饰蛋白,为POFUT催化底物特性的揭示及生物学功能机制研究提供了重要线索。具体研究结果如下:本文通过系统进化树分析找到了四个与人源POFUT1相近的基因,根据同源序列相似性比较及保守催化位点比对选择了At POFUT1和At POFUT2作为候选基因。两个候选基因虽然与人源POFUT1的序列相似性不高,但催化结构域都高度保守,推测它们与人源POFUT1可能具有相似的功能。为了探究O-岩藻糖基转移酶的体外催化活性,在体外通过基因克隆得到At POFUT1及At POFUT2基因,连接p PICZαA质粒并将其导入毕赤酵母体系X-33中进行重组表达。利用HPLC法检测了At POFUT1粗酶的体外催化活性,结果显示有明显底物消耗,说明其可能具有O-岩藻糖基转移酶活性。基于已有转录水平分析提示At POFUT1及At POFUT2在拟南芥植株的生长发育和抗逆抗病中发挥关键作用。为了更好的探索At POFUT1在拟南芥中的生物学功能,筛选并构建了At POFUT1的缺失型及过表达型突变株,多轮筛选鉴定后得到纯合子植株。对突变株的幼苗期和成苗期表型进行观察统计,发现At POFUT1对根长、株高及叶绿素含量无明显影响,但在植株大小及果荚方面发挥作用:相较于野生型,缺失突变体的果荚弱小;过表达突变体普遍植株茁壮,果荚细长。由此说明,At POFUT1对正常的生长发育,特别是叶片和果实发育过程至关重要。探索At POFUT1在植物免疫抗病过程的功能,采用了拟南芥-丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000）植病体系。经表型观察、病情指数、菌落计数以及标记基因表达量统计,结果表明At POFUT1确实参与植株免疫抗病过程。进一步发现免疫诱导子壳寡糖对At POFUT1不同突变体诱导效果有明显差异,壳寡糖预处理可以有效的控制Atpofut中Pst DC3000菌的繁殖,而壳寡糖预处理过表达突变株并无此效果。由此表明植物O-岩藻糖基化的动态平衡在维持正常的免疫响应方面至关重要。为了进一步揭示POFUT的体内生物学功能以及寻找O-岩藻糖基化修饰蛋白,首次在植物中尝试采用代谢标记的方法特异性富集岩藻糖修饰蛋白。通过7-Alkyn yl-fucose进行代谢标记,再利用叠氮修饰的生物素与标记蛋白特异性发生click反应,随后利用链霉亲和素蛋白珠富集标记蛋白。质谱检测共鉴定出16个链霉亲和素蛋白珠特异性结合的蛋白,随后对其进行了生物信息学分析。功能分析表明16个蛋白主要在植株的生长发育过程中起作用,其中有四个蛋白可能参与到植株的抗病抗逆途径中。虽需要进一步的优化和验证,但该方法的建立为后续植物O-岩藻糖基化修饰蛋白组的解析打下了前期基础,也为POFUT催化底物特性的揭示及生物学功能机制研究提供了重要线索。
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