论文部分内容阅读
单核细胞增生性李斯特菌（简称单增李斯特菌，Listeria monocytogenes，LM）是一种常见的食源性致病菌，属于李斯特属（Listeria），是该属中唯一能引起人患病的病原菌。该菌对环境的适应性极强，可在低温、强酸、高盐等极端条件下生存和繁殖。同时，LM还能够穿越机体的多重屏障，引起严重的感染性疾病，如脑膜炎、败血症及流产等，感染后致死率高达20%-30%。近年来，欧美地区不断爆发LM的感染事件，造成了巨大的财产损失和人员伤亡。鉴于LM的高危害性，在食品安全检测的相关项目中LM被列为必检项目。因此，建立准确、高效且适用于食品行业的快速检测方法，具有迫切的现实需求和广阔的应用前景。本文首先以热灭活的LM菌体为抗原免疫BALB/c小鼠，成功筛选获得了6株能稳定分泌抗-LM单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为3F2-A8、8C8-B11、10A11-A4、10E7-H6、11B9-F4、12A6-H11。6株单抗的效价分别为1：320000、1：640000、1：640000、1：640000、1：640000、1：25600。Dot-blot结果表明，6株单抗与李斯特属内菌及部分属外菌存在不同程度的交叉反应。Western-blot结果表明，3F2-A8、8C8-B11、10A11-A4、10E7-H6、11B9-F4的对应抗原为磷壁酸类物质。针对采用菌体免疫制备抗体特异性较差的现状，本文通过构建表达载体pGEX-actA、pET-22b-InlB、pET-22b-iap进行原核表达，并以纯化的InlB和P60为抗原免疫BALB/c小鼠以制备高特异性的抗体。Dot-blot结果表明，抗-InlB多抗能特异性识别LM，与李斯特6种属内菌无交叉反应；抗-P60多抗与LMATCC13932、CMCC54001及其余50株LM食品分离株均有反应，同时也与李斯特属内菌-绵羊李斯特菌NCTC11288、英诺克李斯特菌ATCC19119、威尔李斯特菌ATCC35897存在交叉反应。上述结果表明，原核表达的InlB和P60可用于制备特异性强及亲和力高的李斯特菌单抗。此外，本文进一步以驼源天然噬菌体展示抗体库淘选了针对LM的特异性单域重链抗体。以热灭活的LM菌体为抗原，通过4轮常规淘选和1轮消减淘选。采用phage-ELISA法，对后4轮淘选洗脱物中随机挑选的384个噬菌体克隆进行了鉴定，其中阳性克隆112个。经序列比对、分类及统计，从中挑取10个亲和力较高的克隆进行特异性分析。结果显示淘选获得了2株能特异性识别LM的单域重链抗体，编号为L5-78和L5-79。构建了pET-25b-L5-78和pET-25b-L5-79的表达载体，经大肠杆菌BL21表达纯化获得单域重链抗体。性能分析结果显示2株抗体均可在极端pH、高变性剂及高温下保持较高的活性，具有良好的稳定性。以4A7单抗及L5-79单域重链抗体建立了双抗夹心ELISA法，LM检测限为5×106CFU/mL。总之，本研究通过3种方法制备针对LM的抗体，成功获得了6株单抗、2种多抗血清及2株单域重链抗体。以上研究工作为建立快速检测LM的免疫学方法奠定了基础。