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目的：
本研究旨在探讨非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）细胞源性外泌体对人肺成纤维细胞及NSCLC细胞增殖、凋亡及α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的调控作用；评估NSCLC患者肿瘤细胞源性外泌体中α-SMA与患者临床特征、预后的相关性。
方法：
（1）应用沉淀超速离心的试剂盒分离提取NSCLC细胞A549上清培养液中外泌体。透射电镜和Western blot检测A549外泌体的形态、蛋白标记以及α-SMA的表达。人肺成纤维细胞（HLF1）及NSCLC细胞（A549）中，分别孵育添加PBS的培养基（NC组）、转染α-SMA过表达质粒且孵育添加PBS的培养基（α-SMA组）、孵育添加200μg/mL外泌体培养基（Exosome组）；同时准备鞘磷脂酶抑制剂处理后的A549细胞，将其外泌体抽提物孵育HLF1及A549细胞，作为Exosome-free组。使用CCK-8（cell counting kit-8）检测细胞增殖情况，应用Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡，反转录荧光定量PCR检测α-SMA的转录水平，免疫荧光检测α-SMA的蛋白水平。
（2）设计α-SMA干扰质粒，将α-SMA干扰质粒转染至HLF1及A549细胞中。将A549外泌体与经转染或未经转染α-SMA干扰质粒的HLF1细胞及A549细胞共培养。应用反转录荧光定量PCR检测α-SMA的转录水平，免疫荧光检测α-SMA的蛋白水平，使用CCK-8检测细胞增殖，Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡，Western blot检测p-Janus激酶2（p-Janus kinase2，pJAK2）及p-蛋白激酶B（p-protein kinase B，pAKT）表达量。
（3）纳入160例经手术切除的NSCLC癌患者，收集其癌及癌旁组织，通过试剂盒分离提取组织中的外泌体，使用Western blot检测外泌体中α-SMA的表达量。记录患者的基本特征及肿瘤特征，并随访36个月，记录患者的无病生存期（disease-free survivial，DFS）及总生存期（overall survival，OS）。肿瘤细胞源性外泌体α-SMA表达水平与患者临床特征之间的关联采用Wilcoxon秩和检验或Kruskal-Wallis H秩和检验分析。患者DFS和OS采用Kaplan-Meier（K-M）曲线展示，肿瘤细胞源性外泌体α-SMA高低表达组患者的DFS和OS比较采用log-rank检验分析。DFS和OS的预测因素采用单因素和多因素Cox’s比例风险回归模型进行分析。
结果：
（1）成功分离提取A549细胞培养上清液中的外泌体，外泌体形态呈盘状，表达CD9、CD63、CD86、Flotinlin-1及EEF2标记蛋白，高表达α-SMA蛋白。HLF1细胞中，Exosome组相比于NC组及Exosome-free组增殖上升，凋亡率降低，C-Caspase3表达降低，Bcl-2表达升高，α-SMA的mRNA及蛋白水平上调；Exosome组相比于α-SMA组增殖降低，凋亡率不变，C-Caspase3及Bcl-2表达几乎不变，α-SMA的mRNA及蛋白水平下调；A549细胞中，Exosome组相比于NC组及Exosome-free组增殖上升，凋亡降低，C-Caspase3表达降低，Bcl-2表达升高，α-SMA的mRNA及蛋白水平上调；Exosome组相比于α-SMA组增殖率不变，凋亡率不变，C-Caspase3及Bcl-2表达几乎不变，α-SMA的mRNA及蛋白水平无显著变化。
（2）转染α-SMA干扰质粒后，HLF1及A549细胞中α-SMA转录及蛋白表达量降低，挽救补加A549来源外泌体后，α-SMA表达升高，且与空白对照组接近；转染α-SMA干扰质粒后，HLF1及A549细胞48h及72h增殖率降低，挽救补加A549来源外泌体后，细胞增殖率升高，且与空白对照组接近。转染α-SMA干扰质粒后，HLF1及A549细胞72h凋亡率上升，挽救补加A549来源外泌体后，细胞凋亡率降低，且与空白对照组接近。转染α-SMA干扰质粒后，HLF1及A549细胞pJAK2及pAKT表达量降低，挽救补加A549来源外泌体后，pJAK2及pAKT表达量上升，且与空白对照组接近。
（3）NSCLC患者癌组织中外泌体α-SMA表达量较癌旁组织显著上升。肿瘤细胞源性外泌体α-SMA与患者淋巴结转移、TNM分期以及CEA异常相关。肿瘤细胞源性外泌体α-SMA与NSCLC患者较低的DFS和OS相关，且α-SMA表达量越高，DFS及OS越低。单元回归分析显示，肿瘤细胞源性外泌体α-SMA高表达与NSCLC患者较低的DFS及OS相关，然而多因素回归分析显示，外泌体α-SMA高表达不是预测NSCLC患者DFS或OS的独立因素，推测其可能通过其他独立预测因素（较高的TNM分期及CEA异常）来影响患者预后。
结论：
成功分离NSCLC细胞A549培养上清液中及NSCLC患者肿瘤细胞中的外泌体。A549来源的外泌体中α-SMA高表达，且A549外泌体可调控HLF1及A549细胞的增殖、凋亡以及α-SMA的表达。研究发现，A549来源外泌体可通过传递α-SMA来调控JAK2/STAT3及AKT/MAPK通路的激活，从而促进HLF1及A549细胞的增殖，抑制其凋亡。临床队列研究发现，NSCLC患者肿瘤细胞源性外泌体中α-SMA与患者淋巴结转移、TNM分期、CEA异常相关以及较差的DFS、OS相关。因此，肿瘤细胞源性外泌体中α-SMA是潜在治疗NSCLC的靶点，且能评估NSCLC患者的疾病分期以及总体预后，并能以此改善对NSCLC患者的管理，提高其生存情况。
本研究旨在探讨非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）细胞源性外泌体对人肺成纤维细胞及NSCLC细胞增殖、凋亡及α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的调控作用；评估NSCLC患者肿瘤细胞源性外泌体中α-SMA与患者临床特征、预后的相关性。
方法：
（1）应用沉淀超速离心的试剂盒分离提取NSCLC细胞A549上清培养液中外泌体。透射电镜和Western blot检测A549外泌体的形态、蛋白标记以及α-SMA的表达。人肺成纤维细胞（HLF1）及NSCLC细胞（A549）中，分别孵育添加PBS的培养基（NC组）、转染α-SMA过表达质粒且孵育添加PBS的培养基（α-SMA组）、孵育添加200μg/mL外泌体培养基（Exosome组）；同时准备鞘磷脂酶抑制剂处理后的A549细胞，将其外泌体抽提物孵育HLF1及A549细胞，作为Exosome-free组。使用CCK-8（cell counting kit-8）检测细胞增殖情况，应用Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡，反转录荧光定量PCR检测α-SMA的转录水平，免疫荧光检测α-SMA的蛋白水平。
（2）设计α-SMA干扰质粒，将α-SMA干扰质粒转染至HLF1及A549细胞中。将A549外泌体与经转染或未经转染α-SMA干扰质粒的HLF1细胞及A549细胞共培养。应用反转录荧光定量PCR检测α-SMA的转录水平，免疫荧光检测α-SMA的蛋白水平，使用CCK-8检测细胞增殖，Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡，Western blot检测p-Janus激酶2（p-Janus kinase2，pJAK2）及p-蛋白激酶B（p-protein kinase B，pAKT）表达量。
（3）纳入160例经手术切除的NSCLC癌患者，收集其癌及癌旁组织，通过试剂盒分离提取组织中的外泌体，使用Western blot检测外泌体中α-SMA的表达量。记录患者的基本特征及肿瘤特征，并随访36个月，记录患者的无病生存期（disease-free survivial，DFS）及总生存期（overall survival，OS）。肿瘤细胞源性外泌体α-SMA表达水平与患者临床特征之间的关联采用Wilcoxon秩和检验或Kruskal-Wallis H秩和检验分析。患者DFS和OS采用Kaplan-Meier（K-M）曲线展示，肿瘤细胞源性外泌体α-SMA高低表达组患者的DFS和OS比较采用log-rank检验分析。DFS和OS的预测因素采用单因素和多因素Cox’s比例风险回归模型进行分析。
结果：
（1）成功分离提取A549细胞培养上清液中的外泌体，外泌体形态呈盘状，表达CD9、CD63、CD86、Flotinlin-1及EEF2标记蛋白，高表达α-SMA蛋白。HLF1细胞中，Exosome组相比于NC组及Exosome-free组增殖上升，凋亡率降低，C-Caspase3表达降低，Bcl-2表达升高，α-SMA的mRNA及蛋白水平上调；Exosome组相比于α-SMA组增殖降低，凋亡率不变，C-Caspase3及Bcl-2表达几乎不变，α-SMA的mRNA及蛋白水平下调；A549细胞中，Exosome组相比于NC组及Exosome-free组增殖上升，凋亡降低，C-Caspase3表达降低，Bcl-2表达升高，α-SMA的mRNA及蛋白水平上调；Exosome组相比于α-SMA组增殖率不变，凋亡率不变，C-Caspase3及Bcl-2表达几乎不变，α-SMA的mRNA及蛋白水平无显著变化。
（2）转染α-SMA干扰质粒后，HLF1及A549细胞中α-SMA转录及蛋白表达量降低，挽救补加A549来源外泌体后，α-SMA表达升高，且与空白对照组接近；转染α-SMA干扰质粒后，HLF1及A549细胞48h及72h增殖率降低，挽救补加A549来源外泌体后，细胞增殖率升高，且与空白对照组接近。转染α-SMA干扰质粒后，HLF1及A549细胞72h凋亡率上升，挽救补加A549来源外泌体后，细胞凋亡率降低，且与空白对照组接近。转染α-SMA干扰质粒后，HLF1及A549细胞pJAK2及pAKT表达量降低，挽救补加A549来源外泌体后，pJAK2及pAKT表达量上升，且与空白对照组接近。
（3）NSCLC患者癌组织中外泌体α-SMA表达量较癌旁组织显著上升。肿瘤细胞源性外泌体α-SMA与患者淋巴结转移、TNM分期以及CEA异常相关。肿瘤细胞源性外泌体α-SMA与NSCLC患者较低的DFS和OS相关，且α-SMA表达量越高，DFS及OS越低。单元回归分析显示，肿瘤细胞源性外泌体α-SMA高表达与NSCLC患者较低的DFS及OS相关，然而多因素回归分析显示，外泌体α-SMA高表达不是预测NSCLC患者DFS或OS的独立因素，推测其可能通过其他独立预测因素（较高的TNM分期及CEA异常）来影响患者预后。
结论：
成功分离NSCLC细胞A549培养上清液中及NSCLC患者肿瘤细胞中的外泌体。A549来源的外泌体中α-SMA高表达，且A549外泌体可调控HLF1及A549细胞的增殖、凋亡以及α-SMA的表达。研究发现，A549来源外泌体可通过传递α-SMA来调控JAK2/STAT3及AKT/MAPK通路的激活，从而促进HLF1及A549细胞的增殖，抑制其凋亡。临床队列研究发现，NSCLC患者肿瘤细胞源性外泌体中α-SMA与患者淋巴结转移、TNM分期、CEA异常相关以及较差的DFS、OS相关。因此，肿瘤细胞源性外泌体中α-SMA是潜在治疗NSCLC的靶点，且能评估NSCLC患者的疾病分期以及总体预后，并能以此改善对NSCLC患者的管理，提高其生存情况。