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目的 肝癌是临床上常见的恶性肿瘤。在肝癌组织中C5a受体(C5aR)高表达,并与预后不良有关。LukS-PV是金黄色葡萄球菌分泌的PV-杀白细胞素(Panton-Valentine leukocidin,PVL)中的S组分,课题组前期研究发现LukS-PV能够结合C5aR抑制白血病细胞THP-1的增殖,诱导细胞凋亡,我们推测LukS-PV在C5aR表达增高的肝癌细胞中也可以发挥相似的生物学作用。本课题研究LukS-PV对肝癌细胞增殖,凋亡和侵袭转移的影响,并初步探讨其机制,为其作为靶向药物应用奠定基础。方法 (1)体外培养肝癌细胞HepG2、Hep3B、Huh7、SMMC-7721、Bel7402用不同浓度LukS-PV(0、0.25、0.5、0.75、1μM)刺激24H。(1)用CCK-8的方法检测LukS-PV对肝癌细胞增殖的影响。(2)采用流式细胞术检测LukS-PV对肝癌细胞周期的影响,采用qRT检测细胞周期调控蛋白的表达。(3)采用FCM检测LukS-PV对肝癌细胞凋亡的影响。(4)利用Western blot检测Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase8的表达变化。(2)利用Transwell实验检测LukS-PV对肝癌细胞迁移侵袭的影响和利用Western blot检测EMT相关蛋白的表达变化。(3)用ERK激动剂预处理肝癌细胞,然后用LukS-PV刺激,用Western blot检测EMT相关蛋白表达变化。(4)利用慢病毒C5aR过表达载体和慢病毒C5aR抑制表达载体分别转染Bel7402细胞和HepG2细胞,并用嘌呤霉素筛选后用于后续实验。用荧光定量PCR和Western blot验证转染效果。分为3组进行实验:(1)NC(阴性对照)组(2)NC+LukS-PV刺激组(3)C5aR敲低/过表达+LukS-PV刺激组。利用Western blot检测E-cadherin和N-cadherin的表达变化。结果 (1)LukS-PV对肝癌细胞增殖的抑制作用具有浓度依赖性,并与C5aR的表达水平呈正相关。(2)LukS-PV能够诱导肝癌细胞阻滞在G0/G1期,上调p21基因的表达,下调CyclinA2和CyclinD1的表达。(3)LukS-PV能够诱导肝癌细胞凋亡,诱导凋亡作用具有浓度依赖性。Western blot检测发现LukS-PV可以上调Bax、Caspase3、Caspase8的表达,下调Bcl-2的表达。(4)LukS-PV能够抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。与对照组相比,LukS-PV作用过后E-cadherin的表达明显上调,N-cadherin、snail、twist、vimentin的蛋白明显下调。(5)与对照组相比,LukS-PV能下调ERK蛋白表达,加入ERK激动剂预处理后,LukS-PV抑制EMT的作用明显减弱。(6)在Bel7402细胞中过表达C5aR后,与NC组相比,在C5aR过表达+LukS-PV刺激组中E-cadherin表达明显增加,N-cadherin表达明显下调。在HepG2细胞中敲低C5aR后,与NC组相比,在C5aR敲低+LukS-PV刺激组中E-cadherin表达明显下调并且N-cadherin表达明显增加。结论 (1)LukS-PV具有抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞的凋亡的作用。(2)LukS-PV可能通过抑制ERK磷酸化蛋白的表达而抑制肝癌细胞的EMT。(3)LukS-PV通过与C5aR结合发挥抗肿瘤作用。