论文部分内容阅读
钠钙交换体(Na+／Ca2+exchanger,NCX)是细胞膜上的整合蛋白，在多种细胞起维持细胞钙稳态的重要作用。钠钙交换体有三种同分异构体，即NCX1、NCX2和NCX3。NCX1，也是研究最多的一种钠钙交换体，主要在心脏表达和分布。心脏的NCX以三个Na+和一个Ca2+相交换的方式进行细胞膜两侧的钠钙交换(Na+／Ca2+exchange，NCE)，这种转运是双向的，既可以以Na+入Ca2+出的方式进行，称为正向转运；也可以以Na+出Ca2+入的方式进行，称为反向转运。反向NCE促使Ca2+进入细胞内，触发肌浆网（sarcoplasmic reticulum，SR）释放Ca2+，增强细胞收缩。而正向NCE是收缩完成后引起Ca2+外排的基本机制。研究表明，在多种动物及人体组织，当发生心功能衰竭或左心室肥厚时，均有NCX mRNA和蛋白表达增加，这种交换体的上调，在心衰时被认为是对 山西医科大学博士学位论文2003SR钙转运功能降低的一种代偿，对心肌的收缩和舒张都有积极的作用。另一方面，NCE在心肌缺血再灌注损伤及诱发心律失常的发病过程中起着重要的作用。心肌缺血期间，无氧糖代谢及ATP耗竭导致细胞内『增加，从而激活Na+舰+交换，引起Na+内流和胞内Na+浓度升高。后者又触发NCE，促使CaZ+经反向NCE进入细胞内而引起Ca“十超载。CaZ+超载介导心肌细胞凋亡和坏死，造成心肌损伤。这两方面体现了NCE有利和有害的双重作用。如何恰当应用NCE这把双刃剑，使其充分发挥对机体有益的作用是本实验研究的目的。我们设想，用药物增强正常细胞NCE可分别通过增加反向和正向钠钙交换来提高心肌细胞的收缩与舒张;用药物抑制缺血再灌注早期的NCE，对缺血心肌产生保护作用。为此本研究应用全细胞膜片钳技术研究111类抗心律失常药物dofetilide对NCE的增强作用，并采用单细胞离子成像技术及膜片钳与离子成像同步记录技术观察dofetilide对大鼠心肌细胞Ca“宁瞬变和细胞收缩的影响，以确证增强NCE对心肌细胞收缩和舒张的增强作用。应用膜片钳技术在大鼠心肌细胞观察KB一R7943对NCE的抑制作用，并通过离体心脏灌流观山西医科大学博士学位论文察KB一R7943抑制NCE对大鼠心脏局灶性缺血再灌注损伤引起的左心室功能指标改变及心肌梗塞面积的影响，由此评价抑制NCE对心肌缺血再灌注的保护作用。第一部分Oofeti!1 ed对酶分离的成年大鼠和豚鼠心室肌细 胞Na+/C矿十交换的影响 某些111类抗心律失常药如E一4031，H234/09等显示了正性肌力作用。其机制不仅与延长心肌细胞动作电位时程有关，而且还在于其对钠钙交换的增强作用。Dofetilide（UK一68，798）是一新型的111类抗心律失常药，其作用是通过选择性阻断延迟整流钾通道的快激活成份（I kr）而延长动作电位时程（APD），发挥抗心律失常作用。有研究表明dofetilide对豚鼠和猫乳头肌具有正性肌力作用，并认为其增强心肌收缩力的作用机制是由于延长APD，促进慢钙通道开放而增加细胞内CaZ小。我们以前的研究曾证实dofetil记e的同类药E一4031可激动NCE引起C扩+经反向NCE内流，从而触发sR释放c扩十，增强心肌收缩力。山西医科大学博卜学位论文Dofetilide对NCE是否也有直接的激动作用?对大鼠心肌细胞是否有增强收缩力和促进舒张功能的作用?本研究采用膜片钳和离子成像技术探讨这些问题。1.材料和方法 采用酶法分离、高钾KB液保存技术获得大鼠或豚鼠单个心室肌细胞。实验前取一滴细胞悬液，置于倒置显微镜上的灌流槽中，用含钙1.8 mmol几的台氏液灌流30 min后，选择杆状、横纹清晰、膜良好的心肌细胞进行实验。钠钙交换电流（IN、a）以斜坡电压钳程序（从钳制电位一4omV去极化至+60mV，然后以90mV/S的速率超极化至一12OmV）刺激，由pClampex 8.0软件记录，pClampfit 8.0程序分析计算。2.结果2.1 Dofetilide对大鼠心室肌细胞INa/c。的影响 Dofetilide可增加大鼠心室肌细胞正向及反向NCE电流，这一增强作用呈浓度依赖性（图2）。表1结果表明山西医科大学博上学位论文2003dofetilide 0.03、0.2、0.3、1 .0“mol几可使zN、。内向电流密度C70mV时)分别从0.39士o.20pA/pF增加到0.87土0.38（P<0 .05），1 .33土0.69、1 .86士0.91、2.50士1 .02pA/PF（p<0 .01）。在+somV，dofetilide 0.1、0.3、使IN、。电流密度分别增加0.59士0.401.0林mol几可l，36士0 .59、1.92士o.79p刀pF（P<0.01）。量效关系曲线如图3所示。doftilide对大鼠心室肌细胞外向IN、。的EC50（50%EffectiVe Coneentration）为0.1 83卜Lmol几（95%可信区间（eonfidenee interval，Cl）为0.058一0.520卜Lmol几）对内向IN、e。的ECS。为0.175卜tmoxzL（95%el为0.024一1.296协mol几）。2· 2 Dofetilide对豚鼠心室肌细胞xN:/e，的影响 Dofetilide对豚鼠心室肌细胞IN、。的具有同样的浓度依赖性增强作用（图4，5）。表2结果表明，dofetilide 0.03、0.1、0.3、1.叩mo1，’L可引起IN、。内向电流密度显著增强，在一7omv，分别增加0.3一士o，35（p<0.05），0.98士0.38、一99士一03、3 .86士0.74 pA/PF（p<0.01）?