目的:TC007是以5型腺病毒为载体的重组乙肝治疗性注射液,能在一定程度上模拟病原在体内的复制过程,长时间地反复刺激免疫系统,从而诱导强烈、持久、全面的免疫反应,临床拟用于乙型肝炎的治疗。本研究通过TC007小鼠、食蟹猴一般毒理试验、食蟹猴安全药理试验、小鼠骨髓细胞微核试验、制剂安全性试验,探索TC007临床前安全性,为支持TC007临床试验提供依据。方法:1)C57BL/6小鼠单次给药毒性试验:设置溶媒对照组、1.0×109VP/只、1.0×1011 VP/只和Ad5-null空载体对照组1.0×1011VP/只,共4组,每组6只,雌雄各半。给药容量为0.1 mL/只,单次皮下给药,停药恢复14天。评价指标包括临床观察、体重,IFN-γ ELISPOT检测以及大体解剖肉眼观察。2)食蟹猴单次给药毒性试验:设置溶媒对照组、1.0×109 VP/只低剂量组、1.0×1011 VP/只高剂量组、Ad5-null对照组1.0×1011VP/只,除高剂量每组4只外,其余每组2只,雌雄各半,停药恢复14天。评价指标包括临床观察、体重、心电图、血液常规、血清生化、IFN-γ ELISpot检测(d7)、生物分布(48h、d15)、大体解剖和组织病理学检查。3)食蟹猴重复给药毒性试验:设置溶媒对照组,1.0×109VP/只、1.0×1011VP/只、1.0×1011VP/只低、中、高剂量组及Ad5-null对照组1.0×1011VP/只,每组10只,雌雄各半。每周皮下给药1次,连续7次,停药恢复4周。评价指标包括临床观察、体重、摄食、眼科检查、体温、心电图、血液常规、血清生化、血清电解质、凝血常规、尿液常规,淋巴细胞分群检测(CD3+CD8+T cell、CD4+/CD8+、CD3-CD56+NK cell、CD3+CD56+NKT cell、巨噬细胞 CD45+CD14+)、IFN-γ ELISpot 检测(d7、d35、d45、d68)、肝脏IFN-γ/TNF-α/IL-2免疫组化检测(d46、d71)、免疫原性和免疫毒性检测、生物分布检测(d46、d71)、大体解剖检查、脏器重量、骨髓涂片、组织病理学检查。4)食蟹猴安全药理试验:设置1.0×109VP/只、1.0×1010Vp/只、1.0×1011VP/只TC007低、中、高剂量组,另设Ad5-null对照组(1.0×1011 VP/只)和溶媒对照组,每组6只,雌雄各半,单次皮下给药,于首周期给药前和药后约2 h、4 h、24 h、72 h、120 h、168 h采集至少3 min或3次以上的心血管系统和呼吸系统参数;评价指标包括心血管系统血压(收缩压SP、舒张压DP、平均动脉压mean)、心电图(心率HR、PR间期、QRS间期、QT间期、QTcf)和呼吸系统(呼吸频率Frequ、潮气量TV)。5)C57BL/6小鼠骨髓细胞微核试验,设1×109VP/只、1×1011VP/只TC007低、高剂量组,另设Ad5-null对照组(1×1011VP/只)、溶媒对照组和阳性对照组,每组6只C57BL/6雄性小鼠,皮下注射给药,于给药后24h及48 h各解剖一半小鼠。每只小鼠的骨髓标本在油镜下观察2000个多染红细胞(PCE),计数其中含有微核的PCE细胞数;计数观察200个PCE同时出现的成熟红细胞(NCE)数,计算PCE的比值。6)制剂安全性试验:被动皮肤过敏试验:设TC007低剂量组(2× 109VP/mL,0.5 mL/只)、高剂量组(2× 1010 VP/mL,0.5 mL/只)、阴性对照组(0.9%氯化钠注射液,0.5 mL/只)及阳性对照组(卵清白蛋白8 mg/mL,0.5 mL/只)4个组。致敏血清制备时,采用16只豚鼠(雌雄各半),每组4只,皮下注射进行致敏,隔日1次,共3次,末次致敏后第14天制备致敏血清。皮内致敏及激发时,另取24只豚鼠(雌雄各半),每组6只,皮内致敏时将前期制备的致敏血清用0.9%氯化钠注射液按1:2、1:4、1:8进行倍比稀释,豚鼠背部去毛后选取3点皮内注射相应稀释度的致敏血清0.1 mL,48 h后静脉注射与致敏剂量相同的受试物加等量的0.5%伊文思兰染料共1 mL。激发后约30 min CO2安乐死豚鼠,并取背部皮肤测量内侧斑点的大小。主动全身过敏试验:采用36只豚鼠(雌雄各半),设供试品低剂量组(2×109 VP/mL,0.5 mL/只)、高剂量组(2× 1010 VP/mL,0.5 mL/只)、阴性对照组(0.9%氯化钠注射液,0.5 mL/只)及阳性对照组(卵清白蛋白4mg/mL,0.5 mL/只)4个组,每组8只。致敏时皮下注射给药,隔日1次,共3次。分别于末次致敏后第14天和第21天,静脉注射2倍致敏剂量的供试品或对照品进行激发,观察豚鼠的主动全身过敏反应。家兔皮下刺激试验:采用新西兰兔6♂8♀,设2个组别,供试品组和Ad5-null对照组,剂量均为1.0 × 1011VP/只,右侧腹部皮下注射给予供试品,给药容积为0.5mL/只,单次给药,仅给药1次,给药后72 h两个组别各取2只家兔进行解剖取材;连续3d给药,每天给药1次,末次给药后72 h两个组别各取3只家兔进行解剖取材;剩余动物继续观察14天作为恢复期,以了解刺激反应的可逆程度,恢复期结束后对左右侧腹部皮下注射局部组织取材并进行组织病理学检查。TC007体外溶血试验:新西兰兔心脏采血并制备成2%红细胞悬液,制备完成后将其与0.9%氯化钠注射液及超纯水按照一定比例加入玻璃试管内,混匀后,于37℃生化培养箱中放置30 min,然后,在对应试管内分别加入5 × 108 VP/mL、5 × 109 VP/mL、5× 1010 VP/mL浓度的供试品,混合均匀,并置于37℃的生化培养箱中,肉眼观察TC007对兔红细胞有无溶血或凝聚作用,可见供试品各试验管均未出现溶血及凝聚现象。结果:1)C57BL/6小鼠皮下注射TC007单次给药毒性试验:溶媒对照组、TC007各剂量组及Ad5-null对照组临床症状观察、体重、大体解剖均未见异常。IFN-γ ELISPOT检测结果显示,1.0× 109VP/只、1.0× 1011 VP/只剂量组均能够检测到针对HBV三种抗原(Core、Env、Pol)分泌IFN-γ的特异性T细胞。2)食蟹猴皮下注射TC007单次给药毒性试验:TC007给药组Ad5主要分布于给药局部,在肠系膜淋巴结有少量分布。在给药后48h,Ad5在高剂量组主要分布于给药局部,Ad5生物分布呈明显消除趋势。IFN-γ ELISpot检测显示1.0× 109VP/只、1.0× 1011 VP/只剂量组,均能够检测到针对HBV三种抗原(Core、Env、Pol)分泌IFN-γ的特异性T细胞。体重、心电图、血常规、血清生化等指标在各剂量组均未见药物相关性异常。临床观察可见皮肤红斑,并可见恢复,组织病理学检查可见给药局部轻微表皮结痂、真皮层、皮下组织炎性细胞浸润。3)食蟹猴皮下注射TC007重复给药毒性试验:食蟹猴重复给予TC007后,生物分布检测结果显示Ad5主要分布于给药局部,在腋下淋巴结有少量分布,心脏、肝脏、脾脏、生殖系统及肾脏等组织未见分布。Ad5生物分布呈明显消除趋势。IFN-γ ELISpot检测结果显示,溶媒对照组及Ad5-null对照组均未检测到针对HBV三种抗原(Core、Env、Pol)分泌IFN-γ的特异性T细胞。d7开始在TC007各剂量组外周血即能够检测到针对HBV三种抗原(Core、Env、Pol)分泌IFN-γ的特异性T细胞。给药结束及停药恢复4周后,TC007各剂量组和Ad5-null对照组食蟹猴肝脏组织中IFN-γ/TNF-α/IL-2阳性程度均不同程度高于溶媒对照组,且阳性程度随着剂量的增加而呈增加趋势;但1.0×1011 VP/只和Ad5-null对照组相比,阳性程度未见明显差异。免疫原性检测TC007各剂量组及Ad5-null对照组所有动物均产生抗体;滴度随剂量增加而有所增加;停药恢复4周,各剂量组动物抗体滴度依然较高。中和抗体活性检测结果显示,上述动物产生的阳性抗体均具有中和活性;相同稀释度的动物血清的中和效应与血清中阳性抗体的滴度吻合,且Ad5-null对照组与高剂量组中和效应无差异。与溶媒对照组以及自身给药前后相比较,体重、摄食量、心电图、眼科检查、血液常规、血清生化、血清电解质、凝血常规、尿常规,骨髓涂片,淋巴细胞分群,补体C3、C4等指标在各剂量组均未见药物相关性异常。TC007各剂量组临床观察均可见药后皮肤红斑,TC007各剂量组及Ad5-null对照组体温在给药期间可见轻微升高。TC007高剂量组循环免疫复合物(CIC)与自身给药前和溶媒对照组相比均可见轻微升高(P≤0.05)。给药末期组织病理学检查各剂量组均可见给药局部皮下组织炎性细胞浸润(浆细胞、淋巴细胞)。恢复期结束计划解剖,组织病理学检查可见给药局部皮下组织炎性细胞浸润(浆细胞、淋巴细胞),但与给药末期相比,病变可见明显恢复趋势。4)C57BL/6小鼠及食蟹猴皮下注射TC007安全药理试验:小鼠自发活动试验及小鼠转棒试验未见对小鼠神经系统和机体协调平衡能力异常影响。与溶媒对照组和自身给药前相比,1.0×109VP/只、1.0×1010VP/只和1.0×1011 VP/只剂量组和Ad5-null对照组收缩压、舒张压、平均动脉压和呼吸系统指标均未见药物相关性异常;心率HR、PR间期、QRS、QT间期和QTcf心电指标也未见生理学意义改变。5)C57BL/6小鼠皮下注射TC007骨髓微核试验:给药后24 h解剖的小鼠中MNPCE 比率低剂量组、高剂量组及Ad5-null对照组与溶媒对照组比较均未超过其2倍且未见有剂量相关性。给药后48 h解剖的小鼠MNPCE 比率供试品低剂量组、高剂量组及Ad5-null对照组与溶媒对照组比较均超过其2倍且统计后差异具有统计学意义(P<0.05),且具有一定的剂量相关性,为阳性结果。阳性对照组MNPCE比率明显高于溶媒对照组MNPCE比率,差异具有统计学意义(P<0.05)。6)TC007制剂安全性试验;被动皮肤过敏试验:供试品低剂量组、高剂量组及阴性对照组动物的3个血清注射点均无斑点形成,阳性对照组的动物的3个血清注射点均有斑点形成且斑点直径均>5 mm,在本试验条件下,TC007未见被动皮肤过敏反应。主动全身过敏试验:供试品低剂量组、高剂量组及阴性对照组的动物激发后,均未见过敏反应;阳性对照组动物激发后约17～40s出现过敏症状,约3～6 min死亡。在本试验条件下,TC007对豚鼠未见主动全身过敏反应。家兔皮下刺激试验:结合临床观察及组织病理学检查结果显示,在本试验条件下,供试品及Ad5-null在1.0×1011 VP/只的剂量下,均可对新西兰兔给药部位皮肤产生明显的刺激反应,且该刺激反应经过14天的恢复期后,可见明显恢复趋势。TC007体外溶血试验:结果表明:在3h内,TC007在体外未引起新西兰兔红细胞溶血及凝聚现象。结论:通过科学设计腺病毒注射液TC007的临床前安全性评价方案,在GLP规范条件下进行相关试验研究和评估。结果显示:C57BL/6小鼠单次及食蟹猴单次、重复给药毒性试验,无毒性反应剂量(NOAEL)均为1.0× 1011 VP/只;针对HBV三种抗原(Core、Env、Pol)均可以分泌IFN-γ的特异性T细胞,安全性剂量已经确认,相近评价种属中均未发现明显的靶器官毒性,免疫原性出现亦不影响药理作用,组织分布考察未显.示非预期分布。主、被动过敏反应试验阴性,制剂未引起体外溶血,对神经系统、呼吸及心血管的一般药理研究也未见不良反应。虽微核试验结果显示阳性,但空白载体组也出现类型结果,考虑到临床前外推临床带有一定的局限性,且该类型药物引起染色体损伤的可能性较小。综上所述,其临床前毒理学试验显示具有较好的安全性,参考治疗性生物制品的申报要求,临床前评价内容能够支持该生物药进入临床,进行临床阶段的安全性及有效性研究,同时密切监测可能引起的不良反应。