郫县豆瓣蚕豆醅组合发酵菌剂的理性构建及应用研究

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郫县豆瓣是我国传统特色发酵食品,被誉为“川菜之魂”,受众达数亿人。然而,传统的郫县豆瓣发酵采取暴露于环境中的开放式发酵,受季节、人工操作等因素影响较大,存在明显的批次差异,已难以满足消费者对食品安全、绿色、健康等日益升级的消费需求。除郫县豆瓣外,我国其他传统发酵食品也大多面临同样的问题。参考国际先进案例,采用密闭式发酵罐进行发酵食品的生产可以有效解决批次稳定性的问题,但由于密闭后发酵微生物组成与结构等因素的变化,产品往往存在风味质量下降的问题。因此,本研究以上述问题为出发点,旨在提出一种自下而上的合成微生物组理性构建策略,并基于该策略设计一种与原位功能相似的混合微生物菌剂,作为郫县豆瓣蚕豆醅发酵剂,以供初步的应用和进一步研究。本文主要研究内容及结果如下:(1)为解决郫县豆瓣蚕豆醅核心发酵微生物不清晰的问题,本研究选择在微生物菌群中可能具有重要作用的非致病优势微生物作为潜在的郫县豆瓣蚕豆醅核心微生物。首先以相对丰度大于1%,样本覆盖度大于50%和关联网络节点的特征向量中心性大小三个参数确定郫县豆瓣发酵过程中的重要优势微生物属。然后,在这些微生物属内选择相对丰度最高的OTU对应的物种,且在工业上已广泛使用的菌种或GRAS一般安全菌株,最终认定这些微生物作为核心微生物。结果显示,易变假丝酵母(Candida versatilis)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、融合魏斯氏菌(Weissalla confusa)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)被认定为核心微生物,作为下一步合成微生物组构建的成员微生物。(2)为解决郫县豆瓣微生物风味代谢能力不清晰的问题,本研究设计了一种模拟原位体系的全合成培养基,并基于此解析微生物的风味化合物产生谱。模拟郫县豆瓣原位发酵体系糖类物质与氨基酸含量,本研究设计了一种包含4种单糖、17种氨基酸、8种维生素和多种无机盐的全合成培养基。该全合成培养基主体发酵底物种类及浓度与原位发酵体系一致,且可以满足所有产香功能微生物的生长需求。发酵实验结果显示,使用全合成培养基进行研究具有发酵时间短、批次重复性良好的优势。因此,本研究基于该全合成培养基解析了核心微生物的风味产生谱,并发现上述微生物根据风味产生能力可分为三类,即酵母菌类、乳酸菌类和其他类,不同类之间存在“风味互补”。(3)为构建可用于郫县豆瓣密闭发酵的混合菌剂,本研究提出了一种自下而上的合成微生物组理性构建策略。该理性构建策略以目标微生物的选择和全合成培养基为前提,综合考虑微生物的单菌产香功能、微生物相互作用关系和不同接种顺序的产香差异,从而构建组合菌剂。本研究基于该策略设计了一种由乳酸片球菌、肉葡萄球菌及易变假丝酵母组成的三菌组合菌剂。与企业原位发酵样品相比,三菌组合菌剂产生的挥发性化合物数量和种类结构较为相似。与原位样品相比,组合菌剂样品氨基酸态氮浓度具有21.8%的提升。该组合菌剂及其构建策略在合成微生物组构建与发酵食品工艺改造方面具有较大的科学与应用价值。
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