钠钾ATP酶抑制剂对褐飞虱的毒力及其转运机制

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褐飞虱(Nilaparvata lugens St(?)l)是目前我国水稻上重要的害虫,严重威胁着水稻的安全生产,对我国的农业造成了经济损失。化学防治仍是当前褐飞虱防控的主要手段,但由于长期大量使用化学杀虫剂,导致褐飞虱的抗药性不断上升,致使化学农药的防治效果越来越差。因此,新型靶标杀虫剂的开发成为了褐飞虱防控的迫切需求。钠钾ATP酶(Na+/K+-ATPase、NKA)是真核生物的一种膜蛋白,通过转运Na+和K+来维持细胞内外跨膜的电势差,对生物体内的信号传导和次级转运至关重要。本实验室前期研究发现,NKA基因ATP1A1被干扰后褐飞虱出现了高致死表型,表明NKA是褐飞虱防治的一个潜在靶标。因此,本文研究NKA抑制剂对褐飞虱的毒力,以及它们在褐飞虱体内的转运机制,有助于评估NKA作为新型杀虫剂靶标开发的潜能。主要的研究结果如下:(1)NKA抑制剂对褐飞虱的毒力。选取NKA的两个经典抑制剂乌苯苷和地高辛,分别用显微注射法和人工饲料喂食法测定其对褐飞虱的毒力。结果表明乌苯苷和地高辛对褐飞虱具有非常高的毒力。注射法测定发现乌苯苷和地高辛两者毒力相近,均极显著高于毒死蜱的毒力。人工饲料喂食法测定的乌苯苷和地高辛两者毒力相差非常大,地高辛10-6M浓度的毒力接近于乌本苷10-4M浓度的毒力。我们推测这种毒力差异可能与转运蛋白相关。(2)转运蛋白Oatp和NKA抑制剂的毒力关系。有机阴离子转运多肽(Organic anion transporting polypeptide,Oatp)属于溶质运载转运蛋白超家族,是细胞吸收外源物质的关键蛋白。褐飞虱Oatp蛋白共6个基因,利用qRT-PCR技术检测Oatp蛋白基因在褐飞虱头部、中肠、后肠与马氏管中的表达量,结果发现6个Oatp基因均在肠道中高表达,其中Oatp58Da和Oatp58Db的表达水平最高,且在马氏管中富集表达。将这六个Oatp基因进行RNA干扰后褐飞虱的死亡率均较低,其中仅Oatp1B2和Oatp58Da基因干扰后褐飞虱死亡率与对照组有显著性差异,校正死亡率分别为28.8%和34.1%。选取Oatp1B2、Oatp74D、Oatp58Da和Oatp58Db四个Oatp基因进行RNA干扰,利用人工饲料喂食法测定NKA抑制剂无致死浓度处理对RNA干扰后褐飞虱的毒力,结果表明:四个基因RNA干扰显著提高了乌苯苷对褐飞虱的喂饲毒力;而仅Oatp58Da基因RNA干扰能显著提高了地高辛对褐飞虱的喂饲毒力。(3)转运蛋白Mdr和NKA抑制剂的毒力关系。多药转运蛋白(Multidrug transporter,Mdr)属于ABC转运蛋白家族,参与外源毒素的解毒机制。褐飞虱Mdr蛋白共3个基因,使用qRT-PCR技术检测其在褐飞虱头部、中肠、后肠与马氏管中的表达量,结果显示Mdr蛋白与Oatp蛋白一致,3个Mdr基因均在肠道中高表达,其中Mdr49和Mdr50的表达水平较高,也在马氏管中富集表达。将Mdr蛋白3个基因进行RNA干扰后,褐飞虱均无明显致死表型。对RNA干扰后的褐飞虱喂食含无致死浓度NKA抑制剂的人工饲料,结果表明:Mdr49、Mdr50和Mdr65三个基因RNA干扰均显著提高了乌苯苷与地高辛对褐飞虱的喂饲毒力。综上所述,NKA抑制剂对褐飞虱具有非常高的杀虫活性,表明NKA具有褐飞虱防治靶标的开发潜能;并且发现不同的NKA抑制剂对褐飞虱的喂饲毒力有极显著差异,推测不同的NKA抑制剂在褐飞虱体内转运与代谢途径不同。Oatp和转运蛋白Mdr基因干扰对褐飞虱存活率影响较小,但是能显著提高NKA抑制剂对褐飞虱的喂饲毒力,这为基于多靶标的褐飞虱防治策略研究提供新思路。
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