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肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,在全球范围内严重威胁人类健康,肺癌的早期诊断对于肺癌病人的治疗及预后均具有重要意义。目前研究发现,肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)自身抗体可以在肺癌患者血清中持续稳定的存在,且在肺癌患者血清与正常对照血清中存在差异,提示其可能作为肺癌早期诊断的血清学免疫标志物。目的本研究选择9种肺癌候选TAA(ENO1,p53,Survivin,Koc,IMP1,Ral A,FTL,AHSG和14-3-3ζ),以ENO1重组蛋白为代表进行原核表达纯化从而获得抗原蛋白,进而以获得的重组蛋白为抗原,检测血清中相应抗体含量,评价其对肺癌的诊断价值与意义,并找出一组对肺癌诊断价值较高的TAA并联组合,为TAA作为肺癌血清学免疫诊断指标提供科学依据。方法1.p ET-30a(+)-ENO1重组质粒的构建与ENO1重组蛋白的纯化:将ENO1目的基因片段插入p ET-30a(+)表达载体构建p ET-30a(+)-ENO1重组表达质粒。采用特异性PCR、双酶切以及测序的方法对重组质粒进行鉴定。将p ET-30a(+)-ENO1重组质粒转化至BL21感受态细胞进行表达,并对诱导条件进行优化,采用镍离子亲和层析的方法对ENO1蛋白进行纯化。2.采用蛋白免疫印迹(Western blotting)的方法对纯化后的ENO1蛋白进行验证。3.采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测肺癌患者及正常对照血清中九种TAA自身抗体含量,比较其在两组血清中的水平。4.以正常对照血清中自身抗体含量均值加上两个标准差为截断值,计算自身抗体阳性率,采用筛检试验评价指标评价TAA自身抗体对肺癌的诊断价值。5.用并联检测的方法将7个有意义的指标进行并联,评价各TAA组合对肺癌的诊断价值并找出最佳的TAA组合。结果1.成功构建p ET-30a(+)-ENO1重组表达质粒。序列分析结果显示,ENO1基因编码区序列全长1305bp,与NCBI数据库中公布的人ENO1基因编码区序列同源性为99%;该基因编码的434个氨基酸序列与NCBI数据库中公布的ENO1蛋白氨基酸序列同源性为100%。转化p ET-30a(+)-ENO1重组质粒于BL21大肠杆菌感受态细胞中,通过IPTG诱导条件的优化,确定其最佳诱导浓度为0.01mmol/L,最佳诱导时间为6个小时。并成功获得具有免疫反应性且浓度及纯度均较高的ENO1重组蛋白。2.酶联免疫吸附实验结果:p53,FTL,Koc,Survivin,14-3-3ζ和Ral A 7种指标自身抗体水平及抗体阳性率在肺癌患者血清中均高于正常对照组(P<0.05)。3.单个指标对肺癌的诊断灵敏度普遍偏低,在9.63%-28.89%之间,其中p53自身抗体检测灵敏度最高(28.89%)。说明单个指标对肺癌的诊断价值较低。4.TAA组合检测明显提高了诊断灵敏度及约登指数,其中以p53,FTL,ENO1,Koc,Ral A和Survivin6个指标并联检测效果最理想,其检测灵敏度为52.59%,特异度为86.30%,约登指数为0.39,阳性似然比和阴性似然比分别为3.84和0.55,一致率为69.44%,Kappa值为0.40,为本研究中的最优组合。5.临床特征分析显示,Survivin自身抗体阳性率在老年组(≥60岁)病人中明显高于非老年组(<60岁)(P<0.05),其余肿瘤家族史、远处转移情况、组织分型及肿瘤分期等因素对各指标及6个TAA最佳组合检测肺癌阳性率均无影响(P>0.05)。结论1.肺癌病例组中ENO1,p53,FTL,Koc,Survivin,14-3-3ζ和Ral A 7个TAA自身抗体阳性率高于对照血清,可能是肺癌潜在的生物标志物。2.单个指标检测时诊断价值较低;并联检测p53,FTL,ENO1,Koc,Ral A和Survivin6个TAA自身抗体明显提高其对肺癌的诊断价值。3.肿瘤家族史、远处转移情况、组织分型及肿瘤分期等因素对各指标及最佳TAA组合检测肺癌阳性率均无影响。