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鹅卵黄性腹膜炎,是主要发生于产蛋种鹅的一种急性传染病,产蛋母鹅会因为该病的发生出现生产性能下降、绝产甚至死亡,从而对养殖业造成巨大经济损失。外膜蛋白A是广泛存在于革兰氏阴性肠杆菌外膜上的蛋白,N端具有21个氨基酸的信号肽序列。OmpA又称为热修饰蛋白,是细菌的抗宿主杀伤因子,同时作为微孔蛋白能够维持细菌外膜结构的完整以及细菌的正常形态,同时也是细菌重要的毒力因子,在细菌的粘附和侵袭的起始过程中都起着关键作用。目前对于该病的防治主要是依赖于抗生素,但是随着集约化养殖业的发展以及抗生素治疗的广泛应用,细菌的耐药性也随之增加,多种抗生素的共同使用造成的抗生素残留同时也危害着人类的健康。1.致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌外膜蛋白A的克隆表达以致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌分离株G8107菌株基因组DNA为模板,用PCR法扩增ompA基因,PCR产物用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,酶切产物回收与相同黏性末端的表达载体pET-32a(+)连接构建表达ompA的重组质粒,将此重组质粒转化入表达宿主菌BL21(DE3),抽提质粒,酶切鉴定及测序正确后诱导表达。对转化菌株以IPTG进行诱导后,裂解细菌,离心,上清进行SDS-PAGE鉴定。测序结果显示, ompA基因碱基数为1041bp,编码347个氨基酸残基,蛋白相对分子质量约为36kDa。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以28℃、1.0mM的IPTG诱导5h,该基因表达效果最好,诱导产物是与预期大小相符的54kDa的融合蛋白。经Western blot检测,表达的重组蛋白可与抗His标签蛋白单抗反应,表明本研究成功克隆、表达了大肠杆菌外膜蛋白A,为进一步研究该蛋白功能及其致病机制奠定基础。2.抗致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌外膜蛋白A单克隆抗体的制备以原核表达的致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌OmpA为免疫原,免疫6-8周龄BALB/C鼠3次后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以间接ELISA和有限稀释法进行杂交瘤细胞的筛选,经过两次融合获得7株能稳定分泌抗致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌OmpA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为OmpA-2H11,OmpA-lA3, OmpA-4A7, OmpA-4B8,OmpA-6A6, OmpA-8H10, OmpA-9D3株。经Western-blot分析,这7株均能与OmpA蛋白产生反应,而不与His标签蛋白反应。抗体亚型鉴定表明,2H11,1A3,4A7株为IgGl型,4B8,6A6,8H10,9D3株为IgG2a型。6A6和1A3的腹水抗体效价分别为1：128000和1：32000。在对临床分离到的革兰氏阴性菌的检测中发现,外膜蛋白A并非在所有的革兰氏阴性菌均存在,同时在不同细菌中蛋白大小也存在着差异。3.致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌外膜蛋白A基因缺失株的构建及其相关功能分析基于Red/ET同源重组的原理,通过λ噬菌体的Red同源重组系统对致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌分离株G8107的外膜蛋白A的基因进行敲除,构建△ompA缺失菌株。主要步骤为：根据大肠杆菌ompA的基因和FRT-flanked PGK-gb2-neo cassette卡那霉素抗性片段设计一对含50bp同源臂的引物扩增该片段。利用电转化的方法先后将pRedET质粒和PCR扩增的含同源臂的抗性片段转入大肠杆菌G8107感受态细胞,pRedET质粒能表达重组酶使进入细菌的抗性片段能识别靶基因发生同源重组。在成功构建AompA缺失菌株的基础上,比较分析了野生株和突变株在生长速度、生化特性、药物敏感性方面的生物学特性。生化特性试验表明,与野生株相比,突变株不能正常分解精氨酸、鸟氨酸,能够分解β半乳糖苷,同时分解阿拉伯糖以及乳糖的速度低于野生株：生长速度试验表明突变株明显低于野生株；药敏试验表明,突变株对绝大多数抗生素的药物敏感性均有提升。通过阴道注射经产母鼠构建动物模型,检测突变株毒力变化,结果表明ompA基因的缺失严重影响细菌在易嗜部位的黏附定殖。本实验结果显示OmpA的缺失会造成细菌药物敏感性的增加,因此本研究为新型抗菌药物的研发提供了基础和可能。