研究背景:纳米炭黑(carbon black,CB)是一种常见的超细颗粒物,是燃料不完全燃烧的产物。纳米炭黑广泛应用于橡胶、印刷、涂料等工业。由于其自身结构的特点,常被用于大气污染中含碳颗粒物生物学危害的研究。随着纳米炭黑制品的商业化大气污染细颗粒物日益严重化,纳米炭黑的生物毒性研究越来越受到人们重视。近年来研究表明,纳米炭黑暴露会引起呼吸系统、心血管系统疾病,并与多种癌症的发生有关,同时CB亦会造成神经炎症,诱导星形细胞中谷氨酸和ATP释放。然而,纳米炭黑的神经损伤作用及其机制仍不明晰。该研究通过体内和体外实验,较为全面的探讨了纳米炭黑引起的神经细胞毒性作用及机制,可为纳米炭黑的神经毒性效应评价提供理论依据。研究目的:建立纳米炭黑小鼠亚慢性染毒模型和纳米炭黑暴露的PC-12细胞模型,运用MRI、透射电镜、代谢组学、分子生物学等技术方法,系统探讨纳米炭黑的神经损伤作用。研究方法:体内实验:C57BL/6J雄性鼠随机分成0、0.15 mg/ml、0.5 mg/ml、1.5 mg/ml处理组,每组6只。小鼠鼻腔滴注不同浓度的纳米炭黑20μl,连续暴露三个月,建立纳米炭黑亚慢性小鼠暴露模型。染毒结束后,通过MRI成像技术评估小鼠大脑损伤情况。小鼠处死后,取脑组织,电镜观察小鼠嗅球、纹状体、海马区细胞及细胞器的改变。借助代谢组学手段,观察小鼠纳米炭黑亚慢性暴露后脑代谢物的改变。体外实验:使用CCK-8试剂盒检测纳米炭黑作用后PC-12细胞活力,ATP检测试剂盒观察细胞ATP的变化,总谷胱甘肽检测试剂盒和总SOD活性检测试剂盒检测细胞内抗氧化酶的活性,活性氧检测试剂盒检测细胞内活性氧的变化。Western blot观察细胞线粒体分裂相关蛋白Drp-1,氧化应激蛋白NOX2、NOX4、4-HNE,内质网应激相关蛋白GRP78、IRE1α、ATF6、PERK、CHOP,m TOR信号通路m TOR、p70s6K,自噬相关蛋白Lc3-Ⅱ、Beclin1、ATG5、P62,胰岛素信号通路IRS1、AKT、GSK3α、GSK3β,神经退行性病理蛋白tau的表达,系统阐述纳米炭黑对神经元的损伤作用。研究结果:电镜结果显示,纳米炭黑染毒组小鼠嗅球、纹状体、海马区中均发现纳米炭黑颗粒。与对照组比,纳米炭黑染毒组小鼠幼稚线粒体数目增多,內嵴受损甚至消失。代谢组学分析发现,0.5 mg/ml、1.5 mg/ml暴露组代谢轮廓发生显著性改变。其中,蔗糖、缬氨酸、苯丙氨酸发生了显著下调。而乳酸、甘氨酸、天冬氨酸、琥珀酸等代谢物发生明显上调。经通路富集后发现,纳米炭黑暴露主要影响苯丙氨酸,酪氨酸,色氨酸,缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成,甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢,丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢等。纳米炭黑暴露显著抑制细胞活性,降低ATP的生成,扰乱线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、DJ-1、LRRK2的m RNA水平,上调Drpl的m RNA和蛋白水平,影响线粒体动力学的平衡。此外,纳米炭黑暴露引起细胞ROS生成增多,抗氧化酶活性显著抑制,氧化应激标志性蛋白NOX2、NOX4、4-HNE表达上调,进一步发现,下游内质网应激信号蛋白GRP78、p-PERK、IRE1α、ATF6及CHOP蛋白上调。此外,纳米炭黑暴露抑制m TOR/p70s6K信号通路,引起胞内自噬相关蛋白Lc3-Ⅱ、Beclin1、ATG5、P62水平的上升,自噬流被阻断。纳米炭黑暴露会提高胰岛素通路关键分子IRS1 Ser307位点的磷酸化水平,抑制下游AKT的磷酸化,激活GSK3α、GSK3β蛋白,引起胰岛素信号紊乱,其下游介导的tau蛋白的多个磷酸化位点(ser199、ser214、ser404)上调,引起神经退行性样病理性蛋白的改变。研究结论:1.纳米炭黑对小鼠具有神经毒性,可进入大脑并广泛存在,引起小鼠神经细胞线粒体损伤、脑代谢的改变。2.纳米炭黑会导致PC-12细胞线粒体功能受损,线粒体分裂增多,促进氧化应激反应发生。3.纳米炭黑会引起PC-12细胞自噬水平的上升,自噬流被阻断。4.纳米炭黑暴露引起PC-12细胞胰岛素信号紊乱,诱导细胞tau蛋白的过度磷酸化。