单股负链不分节段负链RNA病毒(Non-segments negative strand RNA virus, NSNSV)主要包括副粘病毒、弹状病毒、波纳病毒和丝状病毒等,是引起动物和人类病毒性传染病的一群重要疫病原。NSNSV的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过病毒基因组cDNA操作获得病毒的过程,是分子病毒学基础和应用研究极为重要的技术手段和工具平台。通过反向遗传操作系统(reverse genetic system)可以有目的的对病毒基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰,可获得相应的突变、重组病毒或疫苗株,为开展病毒相关致病机制和预防疾病方面的研究奠定技术基础。本研究利用反向遗传操作技术,开展了如下三个方面的研究。一、利用方向遗传技术构建双血凝素犬瘟热新型疫苗候选株的研究犬瘟热是由副粘病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus, CDV)引起多种动物的一种急性、热性、高度接触性病毒性传染病。国内外对犬瘟热的预防仍然主要依赖于弱毒疫苗,而弱毒苗在使用过程中存在一些弊端,因此,犬瘟热病毒新型疫苗的研究迫在眉睫。目前本实验室已经成功构建CDV-JP疫苗株反向遗传操作系统。由于CDV血凝素(H)上存在多种中和抗原表位,是诱导机体产生中和抗体的主要抗原蛋白,在抗CDV免疫中发挥着非常重要的作用,在此基础上本研究将本病毒自身H基因序列插入到P基因与M基因间非编码区,构建带有双H蛋白基因的全长cDNA质粒,转染细胞成功拯救出带有双H基因的新型犬瘟热病毒疫苗株(rCDV-JP-2H),并对其进行了病毒生长动力学评价,由于额外插入了H基因,病毒的生长滴度显著减低,在Vero、Vero-SLAM、BSR细胞上的病毒滴度分别为：4.0、4.25、4.3TCID50/mL。以同等TCID50的病毒量免疫犬时,与亲本病毒相比,重组病毒取得了更好的免疫效果：1、当用同样104TCID50的病毒进行免疫犬实验时,重组毒一免后平均中和抗体为1：48(亲本毒为1：24),二免后中和抗体平均为1：160(亲本毒为1：96)；2、当用同样103TCID50的病毒进行免疫犬实验时,重组毒一免后平均中和抗体为1：21(亲本毒为1：7),二免后中和抗体平均为1：107(亲本毒为1：27)；3、当用同样102TCID50的病毒进行免疫犬实验时,重组毒一免后平均中和抗体为1：11(亲本毒为1：5),二免后中和抗体平均为1：64(亲本毒为1：21)。本实验结果为下一步开展更为安全高效的重组CDV活疫苗及CDV病毒相关机制的研究奠定基础。二、犬瘟热病毒小熊猫株全基因序列的克隆及序列分析犬瘟热呈世界性分布,是对我国养犬业,经济动物养殖业、动物园观赏业和野生动物保护业危害最大的疫病之一。本实验室曾从临床上因感染犬瘟热病毒而死亡的小熊猫脏器中分离到CDV,命名为：CDV-LP。经过免疫犬实验发现本株CDV具有良好的免疫原性：一免时中和抗体效价高达到1：128,免疫后观察4个月并没有产生对犬有致病性,具有很好的疫苗开发前景。目前国内外尚未看到关于犬瘟热病毒小熊猫株全长基因序列的报道,为更好的掌握本株CDV的遗传背景,本研究开展了CDV小熊猫分离株全基因组序列的测定及其H基因遗传特性的比较分析。用17对特异性引物,以犬瘟热病毒小熊猫株总RNA为模板,RT-PCR扩增全长基因序列,获得全长cDNA序列。通过DNASTAR软件比较分析发现：犬瘟热病毒小熊猫株基因组全长15690nt,3’端前导序列和5’端尾随序列分别由52个和38个核苷酸组成；其中,各基因片段大小分别为:N1683nt、P1655nt、M1447nt、F2209nt、H1964nt、L6642nt。全基因与强毒株A75/17株的亲缘关系最近,同源性达96.3%；但与Onderstepoort等疫苗株亲缘关系相对较远,同源性为86.6%。遗传进化分析显示犬瘟热病毒小熊猫株属于Asia Ⅰ;其H基因上存在8个潜在的糖基化位点。三、犬瘟热病毒小熊猫株反向遗传系统构建与鉴定为开发对野生动物更安全有效的CDV疫苗,本研究以犬瘟热病毒小熊猫株为模板,用RT-PCR的方法获得包含全长基因的7个片段,通过酶切、拼接将7段不同的CDV基因组序列连接到真核表达载体pCI中,成功构建犬瘟热病毒小熊猫株的全长cDNA表达质粒(pCI-CDV-LP),同时克隆CDV小熊猫株N、P、L蛋白基因构建三个辅助质粒。四种质粒共转染中国仓鼠肾细胞(BSR)细胞,结果：间接免疫荧光、电子显微镜检测、RT-PCR方法均证实了CDV小熊猫株拯救成功。拯救出新的LP株CDV与亲本LP株具有相似的生长动力学特征,为后期通过反向遗传技术对现有的CDV小熊猫株进行定向改造奠定基础。