甘蓝型油菜WRI1和WIN1基因克隆及其功能分析

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脂质合成代谢的调控网络复杂多样,转录调控在脂质代谢中起重要作用。Wrin kled(WRI1)属于AP2转录因子家族,通过转录调控协同性地上调一系列脂质合成代谢相关基因的表达,是油脂合成代谢中的关键调控因子。目前,对于WRI1的研究大多数主要集中在拟南芥中油脂积累方面,其在脂质代谢的整体调控、膜脂与油脂稳定平衡以及植物特别是农作物生长发育方面的作用仍然有待进一步探索。鉴此,本研究通过分子遗传、生化、代谢和细胞学分析等技术分析了甘蓝型油菜WRI1在脂质代谢和植物生长发育中的作用及其分子调控。结果表明:1.甘蓝型油菜中过表达BnWRI1可使植株提前3-5天开花。2.油菜中过表达BnWRI1可显著性提高油菜种子和叶片组织中的油脂含量,且不抑制植株生长以及生物产量和种子产量。3.通过对糖脂代谢及蛋白含量分析发现,植株叶片和种子中蛋白含量及总糖与野生型没有显著性差异,而脂质升高,表明WRI1可同时参与糖酵解途径,过表达WRI1可促进糖类物质向脂质转化。4.脂质组成分析表明WRI1的过表达可促进叶片糖脂DGDG和磷脂酰胆碱PC的合成,同时,WRI1过表达也使发育中的角果糖脂DGDG含量显著低于野生型,取而代之的是TAG含量显著高于野生型,表明WRI1在不同组织行使不同的功能:叶片中的WRI1可促进膜脂的累积确保叶片光合作用的正常进行,而角果和种子的WRI1则可明显增强膜脂向油脂的转化。这些数据表明WRI1不但可以增强FA的从头合成,也可明显促进脂肪酸的组装和膜脂向油脂的流动。5.通过荧光融合蛋白的瞬时表达分析发现WRI1-GFP定位于细胞核,具有转录因子的特性,通过EMSA分析表明WRI1蛋白可特异性地结合于脂质合成代谢通路中相关基因启动子近端区域,且启动子的AW box为其互作所必需,过表达可显著性上调脂质代谢相关基因如PKp、KAD、KAR、BCCP2、GPAT和LPAT的表达。上述结果表明油菜WRI1具有正调控油脂积累的保守功能,BnWRI1通过上调糖酵解和脂肪酸合成途径中的相关基因,增强碳源对脂质合成代谢的流动量,而且具有不同于其他植物WRI1的独特功能,可以广泛性增强脂质合成代谢,并促进糖脂、磷脂和油脂之间的转化和稳态平衡,增强油脂累积和开花进程而又不影响植物生长和产量。此外,本研究还从甘蓝型油菜克隆和表达WIN1蛋白,并构建植物过表达载体转化油菜,获得过表达WIN1株系,初步分析表明WIN1编码的蛋白大小为23 k D;定位于细胞核中,具备转录因子的特性;初步观察发现油菜过表达WIN1植株叶色较绿,其叶片叶绿素含量显著高于对照野生型,且具有较强的耐盐性,在盐胁迫下过表达植株生长优于野生型。
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