【摘 要】
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目的:本实验通过研究金复康口服液在吉非替尼耐药型肺癌中对HIF-1α、PDK1及PDH-E1α蛋白表达的影响,揭示其在肺癌糖酵解过程中的调控作用,并探索金复康口服液在小鼠排泄物中的具有调节糖酵解作用的药效物质,为阐明金复康口服液的抗癌功效提供实验及理论依据。方法:实验一:金复康口服液调节吉非替尼耐药型肺癌糖酵解的体内外机制研究。1.体内机制研究:4-6周雄性裸鼠进行H1975细胞皮下注射,建立肺癌
【基金项目】
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十三五“重大新药创新”科技重大专项，恶性肿瘤等疾病示范性中药新药临床评价技术平台；
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目的:本实验通过研究金复康口服液在吉非替尼耐药型肺癌中对HIF-1α、PDK1及PDH-E1α蛋白表达的影响,揭示其在肺癌糖酵解过程中的调控作用,并探索金复康口服液在小鼠排泄物中的具有调节糖酵解作用的药效物质,为阐明金复康口服液的抗癌功效提供实验及理论依据。方法:实验一:金复康口服液调节吉非替尼耐药型肺癌糖酵解的体内外机制研究。1.体内机制研究:4-6周雄性裸鼠进行H1975细胞皮下注射,建立肺癌裸鼠模型,并随机分为Control组、JFK组、Gefitinib组及JFK+Gefitinib组,分别给予生理盐水、金复康口服液冻干粉溶液（JFK）、吉非替尼以及二者联合应用灌胃,每周测量并记录肿瘤体积2次,21天后处死裸鼠,获取肿瘤组织并检测其HIF-1α、PDK1和PDH-E1α磷酸化的表达水平及乳酸含量,观察皮肤炎症反应。2.体外机制研究:培养H1975细胞,测定JFK及吉非替尼的IC50值。将H1975细胞分为Control组、JFK组、Gefitinib组及JFK+Gefitinib组,相应药物干预后观察H1975细胞平板克隆形成能力;收集细胞提取蛋白及RNA检测HIF-1α、PDK1和PDH-E1α磷酸化蛋白及m RNA的表达情况,同时检测PDH酶活性、ATP及乳酸含量。此外,在缺氧条件下培养H1975细胞,给予JFK干预,检测JFK在缺氧条件下对该细胞的HIF-1α/PDK1轴的调控作用。实验二:金复康口服液的药效物质基础研究。C57BL/6雄性小鼠18-22g予以JFK干预后,分别收集给药前和给药后0-24h的尿液和粪便,并进行前处理,随后采用液相色谱高分辨质谱液质联用技术检测JFK在小鼠排泄物中的化合物,结合质谱数据及化学数据库,分析JFK的药效物质基础,推测其中具有调节糖酵解作用的有效物质。结果:1.体内机制研究:JFK能够抑制裸鼠移植瘤的生长,抑制肿瘤组织中HIF-1α/PDK1轴相关蛋白的表达。与吉非替尼联合应用时,比单用吉非替尼能有效抑制PDH-E1α磷酸化表达,降低乳酸含量。2.体外机制研究:JFK和吉非替尼对H1975细胞IC50值分别为1.08±0.36mg·ml-1和14.35±4.94μmol·L-1。相较于Control组,JFK组、Gefitinib组均能抑制H1975细胞的平板克隆能力,二者联合应用比单用吉非替尼具有更好的抑制效果。JFK和吉非替尼能够抑制H1975细胞的PDK1蛋白及其m RNA表达,降低PDH-E1α磷酸化表达,HIF-1αm RNA、PDH蛋白及其m RNA表达未见统计学差异。单药应用对HIF-1α和ATP的抑制作用不明显,当联合应用时,抑制作用较强,与Control组比较具有统计学差异。与吉非替尼组相比,联合用药能更好地抑制PDH-E1α磷酸化表达,提高PDH酶活性。与金复康组相比,联合给药组能更好的抑制乳酸的产生。3.缺氧条件下,H1975细胞予以JFK干预后,其HIF-1α、PDK1及PDH-E1α磷酸化表达呈下降趋势,但无统计学差异。4.建立了研究JFK在小鼠排泄物中药效物质基础的液质联用方法,共识别124个化合物,包括43个药材化合物和81个代谢物。其中推测出34个化合物化学结构,包括4个杂环类化合物,2个生物碱类化合物,2个酯类化合物,20个黄酮类化合物,2个异黄酮类化合物,1个高异黄酮类化合物,1个环烯醚萜苷类,1个异黄烷类,1个有机酸类化合物。初步对22种化合物进行了药材来源归属,在上述鉴定的化合物中经文献分析推测淫羊藿素和宝霍苷I可能在金复康口服液调节糖酵解的过程中发挥功效。结论:1.金复康口服液能够抑制裸鼠移植瘤及H1975细胞的生长,其作用机制之一可能是通过降低HIF-1α、PDK1及PDH-E1α磷酸化蛋白表达,改变肺癌细胞糖酵解过程,降低乳酸及ATP含量发挥作用,与吉非替尼联合应用时能够增加其抗癌功效。2.缺氧条件下,金复康口服液具有抑制H1975细胞的HIF-1α、PDK1及PDH-E1α磷酸化蛋白表达的趋势。3.结合质谱相关数据及化学数据库,初步探索了金复康口服液在小鼠排泄物中的药效物质基础,并经文献检索推测宝霍苷I和淫羊藿素可能是金复康口服液调节肺癌细胞糖酵解过程的有效物质之一。
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