研究背景在骨损伤的临床治疗工作中,治疗和预防大块骨缺损以及术后骨不连,已经成为骨科亟待解决的难题。传统的植骨手术损伤大、骨量有限,需要一种创伤小、安全有效的方法来代替它,目前组织工程技术已成为解决骨不连和骨缺损的重要方法,采用间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植治疗骨损伤已经成为目前骨科学研究的热点,查阅文献发现MSCs以前的研究重点在于骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs),对于人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)研究较少,并且研究重点在于hUC-MSCs的培养、鉴定、诱导分化、基因修饰等体外实验,对于hUC-MSCs移植的体内作用机制研究文献较少。hUC-MSCs具有MSCs的一般特征“归巢”,当组织损伤后,引入体内的外源性MSCs,趋于向损伤部位和炎症组织转移。在MSCs归巢研究中发现,在相关治疗部位MSCs的检出率低,存活率低,严重影响了MSCs对损伤组织的修复治疗作用。目前对于MSCs向损伤部位或炎症组织归巢的具体机制尚不明确,总结影响MSCs归巢的主要因素包括：组织损伤、移植途径、移植时间、移植细胞数量、体外培养等。移植途径中,动脉移植有增加毛细血管闭塞的可能性,静脉移植相对安全,由于移植细胞同时归巢于肝肺脾等内脏组织,归巢率降低,局部移植能将MSCs直接注入靶器官周围,但存在因缺血缺氧致细胞坏死可能,哪种移植途径最安全最有效尚无定论。另外,关于体外培养对MSCs归巢的影响研究发现,通过体外MSCs扩增,MSCs表面的趋化因子受体(C-X-C chemokine receptor, CXCR)减少,减弱了MSCs的归巢能力。基因修饰能够促进移植MSCs存活、归巢和分化,提高疗效,但经基因修饰的MSCs异位成骨并且成瘤风险升高,而作为目前最常用基因转载工具的病毒,其安全性缺乏验证。成骨分化诱导作为一种体外培养的成熟技术,是否提升hUC-MSCs的归巢和存活能力,未发现相关文献报道。目前体外实验证实hUC-MSCs能够分泌单核细胞趋化因子1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)、组织基质金属蛋白酶抑制剂1、白细胞介素8(interleukin-8, IL-8)等多种细胞因子,这些细胞因子在损伤组织修复的各个阶段发挥着重要作用,体外成骨诱导是否提高hUC-MSCs在体内的旁分泌功能,提高其在骨损伤部位的存活能力,促进骨损伤修复,查阅文献未见相关报道。骨损伤修复相关细胞因子中骨形态发生蛋白(bone morphogenetie proteins, BMPs)在骨祖细胞向成骨细胞(Osteoblast, OB)分化过程中起决定作用,在骨修复的各个阶段发挥着重要作用,是目前骨损伤修复研究中发现的最重要的一组细胞因子。当发生骨损伤时,受骨损伤信号刺激细胞外的BMPs与细胞膜表面的BMPs受体结合,激活受体,通过Smads蛋白传递信号,激活MSCs增殖分化,新生细胞再产生BMPs,形成正反馈,调控骨修复,因此骨损伤部位BMPs的浓度在一定程度上能够反映该部位的愈合能力,本课题通过观察对比骨损伤部位BMP-2的表达,研究不同移植方式和诱导分化对hUC-MSCs提高骨愈合能力的影响。hUC-MSCs移植治疗骨损伤的效果主要取决于hUC-MSCs归巢的数量和归巢后hUC-MSCs对局部微环境的调节两个方面,本课题采用Wistar大鼠制作骨损伤模型,采用静脉移植、局部注射移植以及不同程度的成骨分化诱导,观察hUC-MSCs在骨损伤部位的归巢、存活以及BMP-2的表达情况,探寻提高hUC-MSCs归巢能力和促进骨损伤修复的方法。目的1.对比观察静脉移植、局部移植以及不同程度体外成骨分化诱导,对hUC-MSCs归巢和存活的影响,研究提高hUC-MSCs归巢存活能力的方法。2.采用静脉移植、局部移植以及不同程度体外成骨分化诱导,对比观察hUC-MSCs对骨损伤部位BMP-2表达的影响,研究hUC-MSCs移植提高骨愈合能力的方法。方法1. hUC-MSCs的分离、培养与鉴定取健康产妇足月剖腹产的胎儿脐带组织,使用组织块贴壁法分离获得hUC-MSCs,使用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM培养基,使用胰蛋白酶-EDTA消化液消化传代,取第3代细胞,采用流式细胞仪检测细胞表型CD73. CD105. CD34. CD45的表达,证实hUC-MSCs分离培养成功。2. hUC-MSCs成骨分化诱导及鉴定分别取第6代、第5代和第3代hUC-MSCs,去掉原培养液,加入成骨分化诱导培养液(0.1μmol/L地塞米松、50μmol/L抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、10%FBS的DMEM培养液),成骨分化诱导3天、7天、14天后分别进行细胞移植。采用茜素红S染色法鉴定：成骨分化诱导培养3周后,4%多聚甲醛固定,0.1%茜素红染色,显微镜下观察,证实体外成骨诱导成功。3.制作Wistar大鼠骨损伤模型选用成年Wistar大鼠,采用腹腔注射麻醉,单侧或双侧大腿去毛备皮,纵行切开软组织显露股骨远端,、采用无菌钢锯,横行切割干骺端至髓腔,模拟股骨远端不全骨折,作为骨损伤模型。4. hUC-MSCs在实验动物体内归巢及存活观察小鼠抗人细胞核抗体(mouse anti-human nuclei monoclonal antibody,货号MAB1281)是针对人细胞核的特异性抗体,本研究在静脉或局部注射hUC-MSCs后特定时间切取损伤部位骨标本,采用免疫组织化学技术,特异性显示hUC-MSCs,在显微镜下观察细胞定植情况。5. Wistar大鼠骨损伤部位BMP-2测定BMP-2是骨愈合过程中关键性细胞因子,通过BMP-2的测定来评价损伤部位骨愈合的能力。本研究在静脉或局部移植hUC-MSCs后特定时间切取损伤部位骨标本,选用BMP-2特异性抗体(BA0585),采用免疫组织化学技术染色,显示BMP-2表达,在显微镜下观察。6.实验分组对比研究在hUC-MSCs归巢研究中,采用单侧骨损伤模型,分为静脉移植组和局部移植组,每组内又分为未分化诱导组和体外成骨诱导3天组、7天组、14天组,另外采用双侧骨损伤模型,一侧骨损伤处注射hUC-MSCs,对侧注射生理盐水作为对照,观察双侧hUC-MSCs的定植。在骨损伤部位BMP-2表达的研究中,采用单侧骨损伤模型,分为静脉途径组、局部注射组和空白对照组,前两组内又分为未诱导组、体外成骨诱导3天组、7天组和14天组。7. hUC-MSCs移植对骨损伤模型大鼠全身炎症反应的影响分为骨损伤模型细胞移植治疗组、骨损伤模型未治疗组、健康大鼠空白对照组。骨损伤模型细胞移植治疗组大鼠在细胞移植后7天和14天,腹腔注射麻醉后自尾静脉取静脉血,骨损伤模型未治疗组在相同时间点抽取静脉血,空白对照组大鼠直接抽取静脉血,送济南市第四人民医院检验科检查血常规项目,对比各组白细胞和红细胞含量。结果1.细胞移植后7天,静脉移植组标本hUC-MSCs定植明显少于局部注射组标本,未进行成骨分化诱导和体外成骨诱导3天、7天、14天移植各组标本之间hUC-MSCs定植对比没有显著性差异,双侧骨损伤模型中,注射生理盐水侧标本未发现hUC-MSCs定植。2.细胞移植后14天,体外成骨诱导3天组和7天组hUC-MSCs存活没有显著性差异,但明显多于未进行体外诱导组和体外成骨诱导14天组,局部注射组hUC-MSCs存活明显多于静脉移植组。3.在细胞移植后7天和14天,骨损伤模型细胞移植治疗组和骨损伤模型未治疗组大鼠外周静脉血白细胞含量,各组之间无明显差异,与空白对照组比较有显著性差异。红细胞含量各组之间没有明显差异。4.细胞移植后7天,未进行体外诱导和体外成骨诱导3天、7天、14天细胞移植各组标本之间BMP-2阳性细胞数量没有显著性差异,静脉移植组标本BMP-2阳性细胞明显少于局部注射组标本,所有细胞移植组标本BMP-2阳性细胞明显多于未移植细胞组。5.细胞移植后14天,体外成骨诱导3天组和7天组标本之间BMP-2阳性细胞没有显著性差异,但明显多于未进行体外诱导组和体外成骨诱导14天组,局部注射组BMP-2阳性细胞明显多于静脉移植组,所有细胞移植组标本BMP-2阳性细胞明显多于未移植细胞组。结论1. hUC-MSCs在骨损伤部位的归巢能力,局部移植途径强于静脉移植途径,与体外成骨诱导无相关性。2.体外成骨诱导有利于hUC-MSCs在体内的存活,诱导3天和7天优于诱导14天。3. hUC-MSCs移植后能够促进骨损伤部位的BMP-2表达,体外成骨诱导能够加强该作用。4.骨损伤部位BMP-2表达强度：移植成骨诱导3天和7天hUC-MSCs>移植成骨诱导14天hUC-MSCs>移植未成骨诱导hUC-MSCs>未移植hUC-MSCs5. hUC-MSCs移植治疗大鼠骨损伤,不能抑制全身炎症反应。