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目的:结核病（tuberculosis,TB）作为全球性的严重呼吸道传染病之一,由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tb）感染所引发,传染性强,易迁延不愈。卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin,BCG）作为目前唯一批准用于预防TB的疫苗,已走过百年历史,对儿童粟粒性结核和结核性脑膜炎等重症TB的预防效果值得肯定。然而其保护力缺乏稳定性,尤其对成人TB预防效果不佳。有鉴于此,作为近年来国内外疫苗研制的热点之一,研发新型TB候选疫苗势在必行。本研究根据M.tb在感染不同阶段特异性和致病性的差异,拟选取M.tb潜伏感染时期优势表达抗原以及差异区域（region of differences,RD）基因抗原作为研究对象。首先采用基因重组技术,以大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）作为表达载体,分别构建、表达单个抗原重组蛋白;同时设计融合基因序列,通过全序列合成技术制备融合抗原,并表达相应的融合蛋白。其次,为验证融合抗原及其亚组分抗原是否可被M.tb感染者外周血T细胞特异性识别,拟以特异性蛋白刺激中国M.tb感染者全血,检测人外周血淋巴细胞分泌抗原特异性IFN-γ水平,比较其组间差异。接下来,为判断佐剂对于抗原引发免疫应答类型及水平的影响,拟选取Toll样受体激动剂Imiquimods,构建基于Imiquimods的阳离子脂质体佐剂。最终,以融合蛋白联用脂质体佐剂,作为BCG初免的增强疫苗免疫C57BL/6小鼠,评价其短期及长期免疫原性,同时检测其记忆性免疫应答水平。方法:1、选择M.tb潜伏期优势表达抗原Rv0572c和RD9区抗原Rv3621c,根据Genbank序列构建融合抗原DR2及其亚组分抗原,经双酶切鉴定后,原核表达相应蛋白,以Ni-NTA纯化蛋白后,经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定其表达纯化成功。2、从淮南市肿瘤医院招募受试人群,以TB临床诊断标准对受试人群进行初筛,以全血IFN-γ干扰素释放技术（Whole-blood IFN-γrelease assay,WBIA）测定DR2及其亚组分蛋白诱导不同人群外周血淋巴细胞抗原特异性IFN-γ水平,比较其差异。3、以阳离子脂质体DDA为佐剂形式,加入TLR7/8配体Imiquimods,构建复合型佐剂,联用DR2蛋白制备新型亚单位疫苗。4、选择6～8周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠作为实验动物,将其分为5组,进行两点式皮下免疫:PBS组和BCG组小鼠（接种菌量为1.2×10~6CFU）仅免疫一次;DIMQ组和DR2/DIMQ组小鼠在第0周、第3周、第6周各免疫一次;BCG+DR2/DIMQ组小鼠在以BCG作初次免疫后,在第3周、第6周各以DR2/DIMQ作增强免疫1次（蛋白量为20μg）。5、免疫9周后及免疫18周后,各处死半数小鼠,无菌条件下收集其血清、脾细胞以及肺脏组织,用于后续免疫原性分析:间接ELISA检测小鼠血清中抗原特异性Ig G类抗体产生水平;ELISA检测脾细胞中抗原特异性Th1型细胞因子分泌水平;以流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）和胞内细胞因子染色（intracellular cytokine staining,ICS）检测小鼠脾细胞抗原特异性IFN-γ+CD4+TEM、IFN-γ+CD8+TEM、IL-2+CD4+TCM和IL-2+CD8+TCM细胞水平;q RT-PCR检测肺脏组织抗原特异性细胞因子m RNA表达水平。结果:1、成功构建并表达融合蛋白DR2及其亚组分蛋白,双酶切、SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定无误,分子量均与预期相符,且蛋白特异度及纯度较为理想。2、融合蛋白DR2及其亚组分蛋白在刺激M.tb感染者外周血后,均可诱导其外周血淋巴细胞分泌较高水平的抗原特异性IFN-γ,结果显著高于健康对照组（healthy controls,HCs）（P＜0.01）;融合蛋白DR2刺激M.tb感染者外周血后产生的抗原特异性IFN-γ水平显著高于亚组分蛋白刺激水平。3、经BCG初免后,以融合蛋白亚单位疫苗DR2/DIMQ作增强免疫,免疫后18周可产生较高水平抗原特异性抗体,尤其以Ig G2a最显著,且明显高于免疫后9周水平;BCG+DR2/DIMQ组Ig G2a:Ig G1比值大于1,且随时间延长,更趋向于Th1型免疫应答。4、以PPD或以DR2刺激小鼠脾细胞时,BCG+DR2/DIMQ组在免疫后9周、18周均可产生较高水平的抗原特异性IFN-γ、TNF-α及IL-2;随免疫时间延长,三种细胞因子分泌水平均显著升高。5、免疫后9周或18周,BCG+DR2/DIMQ组小鼠脾细胞DR2抗原特异性IFN-γ+CD4+和CD8+TEM细胞数显著高于BCG组及DR2/DIMQ组;免疫后18周,BCG+DR2/DIMQ组小鼠脾细胞DR2抗原特异性IL-2+CD4+和CD8+TCM细胞数显著高于BCG组及DR2/DIMQ组;且IFN-γ+CD4+和CD8+TEM细胞数随免疫时间延长而减少,而IL-2+CD4+和CD8+TCM细胞数随免疫时间延长而增加;总体上,免疫后9周或18周,IFN-γ+CD8+TEM细胞数显著低于IFN-γ+CD4+TEM,而IL-2+CD8+TCM细胞数在免疫后9周与IL-2+CD4+TCM基本持平,在免疫后18周与其有一定差距。6、免疫后9周,BCG+DR2/DIMQ组小鼠肺脏组织细胞因子抗原特异性IFN-γ、TNF-α及i NOS的m RNA表达水平显著高于BCG组和DR2/DIMQ组;免疫后18周,三种细胞因子表达均随免疫时间延长而增加;免疫后9周和18周,各组间IL-10水平差异无统计学意义。结论:1、本课题所构建的融合蛋白DR2及其亚组分蛋白在刺激中国M.tb感染者外周血后均可诱导受试者外周血淋巴细胞分泌高水平的抗原特异性IFN-γ,其分泌量均显著高于未感染人群,提示融合抗原及其亚组分抗原均可被中国M.tb感染者外周血淋巴细胞特异性识别,且融合蛋白DR2诱导的IFN-γ分泌水平显著高于亚组分蛋白,这表明融合抗原DR2更易被识别。2、在免疫后9周,以BCG初免、DR2/DIMQ作增强免疫的C57BL/6小鼠血清表达高水平的抗原特异性Ig G类抗体,脾细胞及肺脏组织均可分泌高水平的抗原特异性Th1型细胞因子,且其各项免疫指标均随免疫时间延长而增加。这表明以融合蛋白DR2为基础的亚单位疫苗用作BCG初免的异源性增强疫苗时可诱导更强的CD4+Th1型细胞免疫应答,从而有效弥补BCG免疫原性的不足。3、BCG+DR2/DIMQ组小鼠脾细胞在免疫后9周以产生IFN-γ+CD4+TEM细胞亚群为主,在免疫后18周以产生IL-2+CD4+和CD8+TCM细胞亚群为主,表明此免疫策略可充分发挥TEM对于M.tb感染的直接及短期控制作用,以及TCM对于M.tb感染的长期控制作用。4、BCG+DR2/DIMQ组小鼠虽在免疫后9周已显示高水平的免疫原性,其在免疫后18周的各项免疫指标分泌水平及表达水平仍有进一步增加,这表明以BCG初免,以DR2/DIMQ作增强免疫的异源性增强策略可实现长效的免疫应答,呈现出较强的免疫记忆效应。本课题研究为进一步探究DR2/DIMQ的保护效应及预防作用提供前期研究基础,揭示了新型脂质体佐剂DIMQ的效应,同时也为TB新型亚单位疫苗的异源性增强策略研究提供理论及实验支持。图17;表13;参106;