血栓性疾病特别是脑血栓、心肌梗塞、深度静脉血栓等均有较高的致死、致残率，溶栓治疗法是治疗此类疾病的常规疗法。自从二十世纪八十年代以来，已先后开发了多种溶栓制剂，现已被广泛应用于临床，例如：重组组织型纤溶酶原(recombinant tissue-typeplasminogen activator，rt-PA)、尿激酶(UK)、重组链激酶(recombinant streptokinase，r-SK)等，这些溶栓制剂各有优缺点，其中以rt-PA疗效最佳，但因其价格昂贵使用范围受到很大限制。科研工作者正在努力寻找一种既有较好溶栓疗效价格又便宜的新一代溶栓制剂。 天然葡激酶(staphylokinase，SAK)是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种蛋白质。临床研究表明，重组葡激酶(r-SAK)具有与rt-PA相当的溶栓活性，且有更高的纤维蛋白专一性，除此之外，它能在大肠杆菌中高效表达，生产成本低，是一种很有应用前景的溶栓制剂。但临床试验表明，使用r-SAK后仍有一定的再梗塞率，而活化后血小板聚集反应是成功溶栓后再栓塞的主要原因，因此在溶栓的同时进行抗凝、抗血小板聚集治疗是一种积极的预防再栓塞的治疗策略。GPIIb/IIIa拮抗剂能与纤维蛋白原竞争性结合血小板表面的GPIIb/IIIa受体，能够抑制血小板聚集通路的最后一步，具有很强的抑制血小板聚集的作用。国内外根据RGD(Arg-Gly-Asp)序列已设计了许多GPIIb/IIIa受体阻断剂，用于抑制血小板聚集。 为研制兼具溶栓和防栓功能的新型溶栓剂，降低溶栓后再栓塞的发生率，本试验设计在SAK分子的N-端引入RGD序列，构建四个新型双功能SAK突变体分子，研究其表达和纯化，并分析其生物学活性。 本实验采用PCR介导的定点突变的方法，通过设计N-端包含RGD短肽序列的突变引物，以野生型葡激酶(wild type staphylokinase，WT-SAK)质粒为模板，PCR克隆得到SAK突变体基因；将突变后的SAK基因序列与表达载体pBV220质粒连接后，转化大肠杆菌BL2l进行表达：应用阳离子交换层析、凝胶过滤层析和阴离子交换层析连续三步层析法纯化表达产物，并对所得纯化产物进行生物学活性鉴定。实验结果显示，SAK突变体蛋白在大肠杆菌BL2l中的表达量占菌体蛋白总量的50％以上；三步连续层析纯化后其纯度可达97％以上；测得其纤溶比活性分别为10.8×104mJ/mg、10.1×104HU/mg、11.0×104HU/mg、11.2×104HU/mg，不低于WT-SAK的纤溶活性(9.8×104HU/mg)；并且具有明显的抗血小板聚集活性，实验测得血小板聚集抑制率分别为10.72％、12.36％、19.71％、21.65％，明显高于WT-SAK(3.98％)；ELISA分析结果表明，SAK突变体中大肠杆菌菌体蛋白残留量均小于0.1％，符合《中国药典》2005版中规定的要求。本实验中，突变体基因在大肠杆菌中获得高效表达，得到了高纯度、高活性的SAK突变体蛋白。突变体既保留了野生型葡激酶的纤溶活性，同时又具有了抗血小板聚集功能，为新型双功能SAK的研制奠定了良好的基础。