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主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）是由一群位于脊椎动物特定染色体区域基因所编码的高度多态性蛋白分子。MHC分子分布于不同细胞表面，通过呈递抗原来调节免疫应答。不同种动物的MHC及其对应编码产物的名称各不相同。MHC分子家族中的II类分子是由α、β两条链组成的异二聚体。在内质网中，它与自己的γ链聚合，形成九聚体。因为γ链不同于α和β链，呈非多态性，因此称恒定链（Invariant chain, Ii）。作为MHC II分子的重要伴侣蛋白分子，Ii辅助MHC II分子的正确折叠、组装、结构维持和协助呈递外源性抗原肽。在与MHC II分子的α、β链形成九聚体的过程中，其CLIP区(the class-II associated Ii chain peptide)占据MHC II类分子的抗原结合槽，阻止内源性抗原肽与MHC II类分子结合。 Ii与MHC分子的相互作用主要通过真核细胞和原核细胞表达系统进行研究。在真核表达中，通过共转染动物细胞表达，再用激光共聚焦和免疫共沉淀实验观察Ii与MHC分子的相互关系。由于在这两个分子间关系中，需要检测分子间亲和力关系，但是现有的动物真核细胞表达产物难以满足这类实验。为此，本研究探索应用原核表达系统大量表达目的蛋白，以此研究两种分子间的相互作用。 首先，根据GenBank鸡Ii（登录号：AY597053）、B-LA（AY357254）和B-LB（S66480）基因序列，利用自行设计的引物，从实验室保存的各基因cDNA克隆鸡的 Ii、B-LA和 B-LB全长编码区域，将克隆的基因片段分别插入原核表达载体pGEX-4T-1和pET-28a，以及真核表达载体pEGFP-C1和pEGFP-N1中，分别用于转化大肠杆菌 Rosetta（DE3）和转染真核细胞表达真核蛋白。经 PCR、重组质粒双酶切鉴定和测序鉴定，结果表明成功构建6个重组质粒。 其次，将原核表达产物分别经反复冻融和超声裂解处理，GST-Ii蛋白经 GST亲和层析柱（Glutathione Sepharose4B）进行蛋白纯化，His/B-LA和His/B-LB经镍柱进行纯化。在SDS-PAGE电泳中，GST-Ii蛋白分子量为50.8 kD，His/B-LA蛋白分子量为34.1 kD，His/B-LB蛋白分子量为35.3 kD，GFP-Ii蛋白分子量为54.17 kD， GFP-B-LA蛋白分子量为54.84 kD，GFP-B-LB蛋白分子量为56.04 kD，与预期大小一致。用这些蛋白复性后分别免疫小鼠，获得特异性抗体。再用进行经真核表达的相应蛋白作为免疫印迹检测抗原，结果表明这些原核表达产物所诱导产生的抗体能识别和真核表达蛋白。 再次，将重组质粒pEGFP-C1-C-Ii，pEGFP-N1-B-LA或pEGFP-N1-B-LB分别转染293T细胞，观察它们在真核细胞中表达以及表达产物在细胞内的定位。结果表明，它们均能在细胞内表达，并分布于浆膜系统。 最后，为检测原核表达的 Ii、B-LA和 B-LB具有互相结合的功能，将pGEX-4T-1-C-Ii与pET-28a-B-LA或 pET-28a-B-LB共转染工程菌，经诱导表达和复性后，用Glutathione Sepharose4B亲和层析提取结合的复合物。结果表明，共表达产物经亲和柱提纯后，在未经SDS处理的PAGE中，出现复合物Ii/B-LA和Ii/B-LB，再用SDS处理并进行电泳，发现在SDS-PAGE中这些复合物被解离成相应的2个单体条带。 上述这些结果表明，鸡Ii和B-L基因的原核与真核表达的产物能够保持其抗原性，而原核共表达的Ii和B-L蛋白分子复性后在Pull-down中表明它们互相结合。本研究的结果为进一步研究Ii与B分子关系提供方法。