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脑是动物为适应生存需要而发展起来的特殊结构,其主要任务是收集体内外环境的信息,并经过对信息的加工,作出适应环境而有利于生存的决策和反应。人脑是进化的最高成果,已成为极为精巧和完善的信息处理系统。因此,需要从信息运输和处理的角度去考察脑的工作,才能深入揭示脑的工作原理。神经元是脑结构和功能的基本单元,也是脑的基本信息处理单元。轴突运输和突触形成是神经元信息运输和处理的基础。其障碍不仅是诱发神经系统疾病的一个关键因素,而且也是防治神经疾病的一个重要靶点。 本文包含三部分研究内容。首先从轴突运输的方法学入手,建立基于微流控细胞培养系统的线粒体轴突运输成像方法,并开发MitoQuant轴突运输高通量分析软件包;其次以神经退行性疾病ALS相关的RNA结合蛋白(重点研究FUS蛋白)和孤独症谱系障碍相关的非编码RNA(重点研究miR-211)为例,探讨神经系统疾病相关因子在轴突运输和突触形成中的功能和作用机制。 本文第一部分是建立一种针对线粒体轴突运输的成像方法,并发展与之匹配的高效分析软件。首先,我们优化了微流控室芯片技术,使神经元有序生长,并可进行线粒体轴突运输的成像分析;其次,基于线粒体运动的机制,我们研发了线粒体运动的瞬态分析算法;最后,我们建立了线粒体轴突运输的量化指标,用以描述线粒体的轴突运输方式。在此基础上通过实验验证了分析方法和软件的有效性。 本文第二部分,运用实验室已经建立的FUS蛋白病的细胞和果蝇模型,研究了FUS在神经元线粒体轴突运输的功能和作用机制。首先,在大鼠皮层神经元和果蝇运动神经元中过表达野生型FUS(FUSwt)或者突变体FUS(FUSP525L),运用活体成像技术,发现FUS野生型和突变体都可影响线粒体轴突的双向运输。具体表现在:处于静止状态的线粒体比例增加,且这种静止状态持续时间变长;同时处于动态暂停和运动状态的线粒体比例降低。把过表达FUSP525L的果蝇和Miro1蛋白下调的果蝇进行杂交,观察运动神经元线粒体的运输,发现Miro1的下调可以挽救FUSP525L导致的线粒体双向运输损伤。为探索FUS蛋白的作用机制,在HEK293细胞中过表达FUSwt或FUSP525L,发现参与线粒体运输相关蛋白Miro1泛素化水平增加。综上所述,我们发现了Miro1蛋白介导了FUS在线粒体轴突运输中的功能。 本文第三部分,利用生物信息学方法分析了孤独症谱系障碍(ASD)相关致病因子的数据库,并选择miR-211为研究对象探索其在ASD中的功能及分子机制。ASD的病因非常复杂,遗传研究方法多种多样,不同的研究方法可能产生不同的结果。首先,我们应用生物信息学方法,将ASD全基因组连锁分析和基因拷贝数变异分析结果与表型关联起来,对研究的结果进行整合。其结果为研究单基因在ASD中的功能提供新的依据。其次,我们以位于孤独症易感区域15q11-13.3内的非编码RNA,miR-211为例,探索其在轴突和树突发育中的功能。我们的实验结果显示:在小鼠海马神经元中发现miR-211在神经元发育早期抑制了轴突的生长;然后在神经元发育后期,促进了树突和树突棘的发育,并引起树突棘密度增加和兴奋性突触蛋白PSD-95表达增加。于此同时,通过miR-211作用靶蛋白的预测与实验验证,我们发现miR-211过表达降低了小鼠抑制性突触蛋白GABA受体的表达水平。根据以上研究结果,我们推测由于miRNA的时效性和作用靶基因的广谱性,miR-211在神经系统发育的不同阶段起到了不同的作用。 综上所述,我们开发了轴突运输高通量成像和分析软件包,为后续致病基因的功能研究提供了新的研究手段。其次,我们初步探讨了FUS在轴突运输中的功能与致病机制,为FUS蛋白病的致病机理提供了新的依据。最后,我们分析了ASD易感基因miR-211在树突棘发育中的功能,并鉴定了miR-211在突触传递通路中的作用,为ASD复杂的致病机制提供了新的线索。