摘要：原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在各类癌肿中的发病率居第三位，其恶性程度高，病情发展迅速，病死率高，每年我国有11万人口死于肝癌，占全世界肝癌死亡总数的45%，严重威胁着我国人民的身心健康。因而，深入研究肝癌的发病机制、生物学特性，实现对肝癌的有效防治具有重要的意义。但是，对肝癌进行实验研究不能直接在人体进行，需要建立便于体内研究肝癌的肝癌动物模型和体外研究肝癌的肝癌细胞系，因此，细胞系（株）在肿瘤理论和应用研究上具有十分重要的价值。由于肿瘤的异质性和复杂性，不同种族和地域来源的细胞，其一些特性和针对性可能不尽相同，所以，建立来源不同的肝癌细胞系对于深入研究具有重要意义。为了更好的开展肝癌的防治研究，我们肿瘤研究所进行了肝癌细胞系的建系培养工作，并成功建立了6株肝癌细胞系。本课题对已建系的6株肝癌细胞进行了体外生物学特性及其成瘤性研究，为其进一步应用于肝癌的细胞生物学、分子生物学、分子遗传学、免疫学和实验治疗学的研究打下基础。近年来，TNF家族及其受体超家族倍受科研工作者的关注，新发现的TRAIL已成为肿瘤研究中的一个热点。TRAIL，即TNF相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor （TNF）-related apoptosis inducing ligand），Ⅱ型跨膜糖蛋白，被称为继Fas和TNF之后的第三个死亡因子。TRAIL通过其受体DR4、DR5诱导凋亡,最大的特点是能使大部分突变细胞发生凋亡，而正常细胞不会凋亡。我们研究了TRAIL蛋白对上述6株肝癌细胞的体外杀伤效应，并在KYC荷瘤裸鼠上进行了实验性治疗研究。本研究主要包括三部分内容：第一部分 6株肝癌细胞系的生物学特性研究。6株肝癌细胞已在体外培养均超过100多代。通过对六株细胞系的体外培养，我们发现：1）六株细胞具有相同肿瘤细胞的特性：细胞大小不一，排列紊乱，有梭形，圆形，多角形，细胞长满瓶底后有重叠现象，细胞失去接触抑制生长，核质比例倒置等；2）6株细胞的倍增时间介于20-60小时之间；3）用常规染色体标本制备方法, 得出5株细胞的染色体平均数为：GBY51条、KYC56条、LYX105条、QYC53条、XSM50条（另外1株细胞未分析）。3）用ELISA方法在培养上清中均未检测到甲胎蛋白、白蛋白、乙肝表面抗原及前S抗原的分泌；4）6株细胞的LDH同工酶谱与临床肝癌一致；5）细胞周期分析结果<WP=6>显示：与外周淋巴细胞相比，6株细胞在S期的细胞数比例增加，其DI指数分析与染色体结果一致。第二部分 6株肝癌细胞系的体内成瘤性研究。将6株细胞接种于BALB/c裸鼠，接种20天时，接种KYC细胞的裸鼠均可见直径约0.5cm大小的肿瘤，成瘤率100%；LYX于接种25天时有两只可见直径约0.3cm大小的肿瘤，成瘤率为50%，余4株细胞观察70天后均未出现肿瘤。所有裸鼠尸检，均未发现转移病灶。将实体肿瘤剥离分别做原代培养和病理检测，原代培养的细胞其形态、细胞倍增时间与其原接种细胞相一致。将其体外培养的细胞再次接种裸鼠，KYC于接种10天时均可见直径约0.3cm大小的肿瘤，成瘤率为100%；LYX于接种15天时可见直径约0.3cm的肿瘤，成瘤率为75%。通过对六株细胞系的成瘤性研究，我们筛选出两株体内能成瘤的细胞株，并且通过两次裸鼠体内筛选，我们筛出二株高成瘤性的细胞系，已在体外培养了18代。这为以后肝癌实验动物模型的建立提供了新的细胞来源。第三部分 TRAIL蛋白对6株肝癌细胞的体外杀伤及动物实验研究。我们研究了TRAIL对6株肝癌细胞的体外杀伤效应，筛选出了对TRAIL高敏感性的细胞株，采用KYC细胞系建立了肝癌实验动物模型，对TRAIL的毒性及体内抗肝癌作用进行了初步研究。体外研究显示，TRAIL蛋白对6株细胞均有杀伤作用，比较其对6株细胞的ED50值，我们得出XSM对TRAIL 最敏感，依次是QYC、GBY、 KYC、XJC、LYX。用我们已建立的KYC动物模型对其进行体内研究，治疗组（连续10天腹腔注射500ug/day）、对照组（同法注射等体积的生理盐水/day），观察五周后，对照组肿瘤生长速度明显比治疗组快；治疗组有两只于治疗第12天、14天死亡，尸检未发现癌转移病灶，但两只动物肝脏大体观察均呈黑红色，表面不光滑，均散在大小不等的结节，质地较硬；另两只于第35天死亡，尸检结果同上。治疗35天后，处死对照组及治疗组的裸鼠，尸检对照组肝脏未见异常，治疗组结果同上。另外我们还采用昆明种正常小鼠腹腔注射TRAIL蛋白来检测TRAIL的毒性，未见明显的肝脏毒性。然后我们又用同样的方法对BALB/c裸鼠进行了毒性研究，结果同治疗组。结果提示：TRAIL蛋白对体外培养的肝癌细胞有较强的杀伤作用，但在体内效果不显著。我们的毒性研究表明：TRAIL对BALB/c裸鼠有较大的肝脏毒性，而对昆明种小鼠肝毒性很小。TRAIL蛋白的毒性可能与小鼠品系有关。所以，TRAIL的分子结构有待进一步改进，其在肿瘤治疗中需要进一步深入研究。总之，我们研究了新建系的6株肝癌细胞的一般特性，并检测了TRAIL蛋白对<WP=7>以上细胞的体外杀伤作用及动物实验研究，获得已下结果：1、6株肝癌细胞系均具有一般肿瘤细胞的特性：细胞形态不一，大小不等，失去接触抑制；6株细胞的LDH同工酶谱与临床肝癌的一致；染色体