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研究目的：1.研究观察TIMP-3在人外周血单核细胞向树突状细胞(DCs)分化过程中的表达以及成熟刺激对DCs表达TIMP-3的影响,探讨TIMP-3在DCs分化过程中诱导性表达的机制。2.研究观察TIMP-3对LPS刺激成熟的人单核细胞来源DCs的表型以及细胞因子分泌的影响,探讨TIMP-3抑制DCs表面共刺激分子CD86表达以及细胞因子IL-12分泌的机制。3.研究观察TIMP-3对LPS刺激成熟的人单核细胞来源DCs诱导初始T细胞极化能力和方向的影响,探讨TIMP-3对T淋巴细胞免疫应答类型的影响,为以TIMP-3为基础的抗肿瘤治疗研究提供免疫学理论基础。研究方法：1.以人单核来源的DCs为研究对象,分别在转录水平和蛋白水平检测单核细胞向DCs分化过程中TIMP-3的表达。取健康志愿者的外周血浓缩粒细胞,采用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,CD14+磁珠分选纯化获得外周血单核细胞。纯化后的外周血单核细胞在含有IL-4,GM-CSF和10%胎牛血清的RPMI1640培养基中诱导培养。诱导5天成为未成熟DCs(imDCs),加入LPS或TNF-a继续培养48小时,刺激形成成熟DCs (mDCs)。在单核细胞向DCs诱导的第0、1、3、5天和第7天,取细胞采用RT-PCR检测TIMP-3mRNA的表达。取新鲜分离的单核细胞和imDCs进行免疫荧光染色,采用激光共聚焦显微镜观察TIMP-3蛋白的表达和细胞定位。采用ELISA方法检测imDC培养上清中TIMP-3的分泌。2.以人单核来源的DCs为研究对象,探讨单核细胞向DCs分化过程中TIMP-3诱导性表达的机制分别采用标准浓度的IL-4配合梯度浓度的GM-CSF或梯度浓度的IL-4配合标准浓度的GM-CSF诱导单核细胞分化,于培养第5天收集细胞,qRT-PCR方法检测TIMP-3mRNA的表达,以确定IL-4和GM-CSF在诱导TIMP-3表达中各自的作用。采用p38MAPK抑制剂SB203580、JAK3抑制剂ZAM39923或PI3K抑制剂wortmannin预处理单核细胞1小时,PBS洗三遍后,再采用IL-4和GM-CSF诱导细胞分化3天,收取细胞用qRT-PCR方法检测TIMP-3mRNA的表达。分别采用标准浓度的IL-4或GM-CSF诱导单核细胞0、5、15、30和60分钟,收集细胞提取细胞总蛋白后,应用western-blot方法检测各时间点磷酸化p38和总p38的表达量,分析p38的磷酸化水平变化。以p38MAPK抑制剂预处理单核细胞1小时,后用标准浓度的IL-4诱导60分钟,然后采用p38MAPK活性分析试剂盒检测p38MAPK激酶活性。3.以人单核细胞来源DCs为研究对象,采用脂质体介导siRNA转染沉默DCs中TIMP-3基因的表达以脂质体为载体转染siRNA沉默DCs中TIMP-3的表达。取imDCs经PBS洗涤后,加入无血清RPMI1640培养基。将细胞分为空白对照组、阴性载体对照组和干扰组,分别加入Lipofectamine2000、阴性对照siRNA和TIMP-3siRNA,室温孵育4小时后加入含IL-4、GM-CSF和LPS的全陪,继续培养48小时后收集细胞,提取总蛋白用western-blot检测不同实验组中TIMP-3蛋白表达水平,计算TIMP-3沉默效率。4.外源性rhTIMP-3或TIMP-3基因沉默对LPS促成熟DCs表面标志表达及细胞因子分泌影响的检测以IL-4和GM-CSF诱导第5天的imDCs为研究对象,在LPS刺激其成熟的过程中同时加入人重组TIMP-3,作用48小时后收集细胞,用流式细胞仪检测DCs表面成熟标志及共刺激分子HLA-DR、CD14、CD40、CD80、CD83和CD86的表达；收集细胞培养上清,高速离心后采用悬浮芯片技术检测细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α分泌水平。收集TIMP-3siRNA转染沉默后的imDCs,以LPS刺激48小时促成熟后,用流式细胞仪检测DCs表面成熟标志及共刺激分子HLA-DR、CD14、CD40、 CD80、CD83和CD86的表达；收集干扰后DCs培养上清,高速离心后采用悬浮芯片技术检测细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α分泌水平。5.探讨分析TIMP-3抑制LPS促成熟DCs表面共刺激分子CD86表达和细胞因子IL-12分泌的机制采用不同浓度的PI3K抑制剂wortmannin或对照DMSO预处理imDCs1小时,PBS洗涤后,采用LPS或LPS加TIMP-3刺激48小时促进DCs成熟。收集DCs培养上清,高速离心后采用悬浮芯片技术检测细胞因子IL-10、IL-12和TNF-α分泌水平。采用500nM wortmannin或对照DMSO预处理imDCs1小时,PBS洗涤后,采用LPS或LPS加TIMP-3刺激48小时促DCs成熟,分别在刺激过程中的第0、6、12、24和48小时,收集细胞培养上清,高速离心后采用悬浮芯片技术检测细胞因子IL-12分泌水平；收集促成熟48小时后的各组DCs,采用流式细胞仪检测细胞表面共刺激分子CD86的表达。imDCs经LPS或LPS加TIMP-3刺激30分钟,收集细胞提取总蛋白后,采用western-blot技术检测Akt磷酸化蛋白水平。imDCs经TNF-α或LPS或LPS加TIMP-3刺激48促成熟,分别在刺激过程中的第2、4、8、16、24和48小时的细胞,提取细胞总RNA,应用RT-PCR方法检测MARCH1mRNA的表达。6.外源性rhTIMP-3或TIMP-3基因沉默对LPS促成熟DCs诱导初始T细胞极化能力及方向影响的检测取健康志愿者的外周血浓缩粒细胞,采用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,D4+CD45RA+T细胞阴性磁珠分选法纯化外周血初始T细胞。纯化后的初始T细胞与不同条件下诱导培养的成熟DC,按照5：1的比例混合共培养6天,收集培养上清,悬浮芯片检测Th2细胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和Thl细胞因子IFN-γ的分泌水平；或于混合培养第6天,在brefeldin A存在的环境中,加入PMA和ionomycin继续培养5-6小时,细胞经固定破膜后采用流式细胞仪检测胞内IL-4和IFN-γ的水平。结果：1.单核细胞不表达TIMP-3, TIMP-3在单核细胞向DCs分化的过程中呈诱导性表达特征RT-PCR结果显示,新鲜分离的人外周血单核细胞不表达TIMP-3mRNA,在IL-4和GM-CSF刺激单核细胞向DCs分化的过程中,TIMP-3呈诱导性表达。imDCs经LPS或TNF-α刺激成熟后,TIMP-3的表达降低(P<0.05)。免疫荧光检测显示,单核细胞不表达TIMP-3蛋白,imDCs中表达的TIMP-3位于胞浆内和细胞核内。ELISA检测imDCs培养上清,未检测到TIMP-3;若采用肝素孵育imDCs8小时,或采用Triton X-100或SDS处理imDCs5分钟,上清中可检测到TIMP-3的表达。2.在单核细胞向DCs分化过程中,IL-4通过激活p38MAPK信号通路诱导TIMP-3的表达采用标准浓度的GM-CSF培养梯度浓度的IL-4诱导单核细胞分化,结果显示随着IL-4浓度的提高,转录水平TIMP-3的表达逐渐增加。而采用标准浓度的IL-4配合梯度浓度的GM-CSF诱导单核细胞分化,转录水平TIMP-3的表达各组无显著差异,提示IL-4在TIMP-3的诱导性表达中起决定作用。采用p38MAPK信号通路抑制剂SB203580预处理单核细胞后,IL-4诱导TIMP-3表达的能力显著降低(P<0.05)。而JAK3抑制剂ZM39923和P13K抑制剂wortmannin预处理对IL-4诱导TIMP-3的表达无显著影响。Western-blot结果显示,GM-CSF不影响单核细胞p38MAPK磷酸化水平,而IL-4则诱导单核细胞p38MAPK磷酸化显著增强。p38MAPK活性分析显示,IL-4能够显著增强p38MAPK的激酶活性,其抑制剂SB203580显著抑制其活性。3.脂质体介导siRNA转染有效沉默DCs中TIMP-3基因的表达采用western-blot检测脂质体介导siRNA转染沉默DCs中TIMP-3表达的效率。结果显示,RNA干扰基因沉默TIMP-3后,DCs表达TIMP-3蛋白显著降低(P<0.05),降低水平超过50%。4.TIMP-3抑制LPS刺激成熟DCs表面共刺激分子CD86的表达,抑制DCs分泌细胞因子IL-12收集单一LPS刺激成熟的DCs, LPS加rhTIMP-3刺激成熟的DCs以及TIMP-3基因沉默后的经LPS刺激成熟的DCs,采用流式细胞术检测其表面成熟标志及共刺激分子的表达,结果显示TIMP-3不影响DCs表面HLA-DR、CD14、CD40、CD80和CD83的表达,但显著降低共刺激分子CD86的表达,而TIMP-3基因沉默显著增强CD86的表达。悬浮芯片细胞因子检测结果显示,TIMP-3单一刺激不能改变DCs细胞因子的分泌,而TIMP-3可以显著抑制LPS刺激的IL-12和TNF-α的产生(P<0.05),不影响LPS刺激的IL-1β、IL-6和IL-10的产生;TIMP-3基因沉默后以LPS刺激DCs使IL-12和TNF-a的产生显著增加(P<0.05)。5. TIMP-3通过进一步激活PI3K信号通路抑制LPS刺激成熟的DCs分泌IL-12,通过抑制LPS刺激引起的MARCH1表达降低增强CD86的泛素化采用不同浓度P13K抑制剂wortmannin预处理imDCs后,TIMP-3抑制LPS刺激的IL-12产生的效应被逆转。500nM wortmannin能够完全逆转TIMP-3对IL-12的抑制效应,而对IL-10和TNF-a在TIMP-3存在的情况下的分泌无显著影响。动态IL-12分泌结果显示,第6小时1L-12的分泌恢复至正常水平。检测PI3K下游信号分子Akt的磷酸化水平结果显示,TIMP-3能显著增强Akt的磷酸化。Wortmannin预处理DCs虽能恢复IL-12的分泌,但并不能恢复TIMP-3引起的DCs表面CD86的表达抑制,相反是进一步降低CD86的表达。RT-PCR检测与DCs表面CD86泛素化密切相关的分子MARCH1的表达结果显示,TIMP-3能够显著抑制LPS刺激引起的MARCH1表达降低,因此推测TIMP-3可能通过MARCH1介导的泛素化降低CD86的表达。6. TIMP-3使LPS刺激成熟的DCs诱导的初始T细胞呈Th2偏倚不同条件下诱导成熟的DCs与初始T细胞共培养,流式细胞术检测胞内细胞因子表达结果显示,TIMP-3显著降低产IFN-γ细胞的比例,显著增强产IL-4细胞的比例。悬浮芯片检测上清中细胞因子分泌结果显示,TIMP-3显著降低IFN-γ的分泌,显著增强IL-4的分泌。导致IL-4/IFN-γ、IL-5/IFN-γ、IL-10/IFN-γ和IL-13/IFN-γ的比例增大,诱导的T细胞呈明显Th2偏倚。Wortmannin预处理DCs逆转了TIMP-3的上述效应。结论：1.单核细胞不表达TIMP-3,在向DCs分化过程中,IL-4通过激活p38MAPK信号通路诱导TIMP-3的表达。LPS或TNF-a介导的成熟刺激使DCs中TIMP-3的表达降低。2. TIMP-3抑制LPS刺激成熟DCs表面共刺激分子CD86的表达和细胞因子IL-12的分泌,这提示TIMP-3可能改变LPS刺激成熟DCs的诱导初始T细胞极化的能力和方向。3. TIMP-3通过进一步激活PI3K信号通路抑制LPS刺激成熟DCs分泌细胞因子IL-12。4. TIMP-3可能通过抑制LPS引起的MARCH1表达降低,从而增强由MARCH1介导的CD86泛素化效应,使CD86的表达降低。5. TIMP-3使LPS刺激成熟的DCs诱导的初始T细胞向Th2方向极化。因此,以TIMP-3为基础的抗肿瘤治疗研究的效果尚需进一步评价。