因近来干细胞研究的重大进展及应用材料和塑型科学的发展和完善，利用血管组织工程方法构建良好血管替代物已成为组织工程学领域中的研究热点。种子细胞获取、培养和种植的研究是组织工程化血管研究的关键性环节；血管完全内皮化是组织工程血管应用于体内移植的前提；在体外构建不引起免疫排异反应的，能维持管腔长期通畅的血管移植物是血管组织工程研究的目标。 本实验采用脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠去除新鲜组织中的细胞，制备脱细胞血管支架与瓣膜支架。脱细胞结果以HE染色和五色法胞外基质染色进行评价。胶原酶灌注法获取脐静脉内皮细胞，培养一周后用普通光镜大体观察和免疫组化鉴定。脐静脉内皮细胞以2x105／cm2的密度种植于去细胞支架上，静态培养10天。用0．5ttg／ml的DAPI溶液对再内皮化支架进行直接的大体染色及染色后冰冻切片，于荧光显微镜下观察内皮化情况。同时用HE染色，免疫荧光染色和扫描电镜对支架的内皮化情况进行平行观察。脱细胞支架细胞成分完全脱去，胞外基质保存完好；分离的细胞培养一周后，细胞呈梭形或多角形，核仁清晰，大小均匀，呈典型的铺路石样；免疫荧光检测可见细胞浆内有颗粒状红色阳性信号，说明Ⅷ因子相关抗原染色阳性；膜表面有蓝色阳性信号，说明CD31抗原染色阳性。内皮细胞种植10天后，支架经DAPI大体染色显示内皮化程度达90％以上，且细胞分布均匀，观察结果与电镜观察相同；染色后冰冻切片观察显示支架表面有一融合的内皮细胞单层，与免疫荧光染色及常规HE染色结果相吻合。DAPI大体染色法可直接观察生物支架再内皮化程度，方法简便、迅速、观察结果准确直观，是研究体外构建组织心脏瓣膜的一种有效地形态学方法。 采用贴壁筛选法分离人骨髓间质干细胞，用普通光镜大体观察、流式细胞术鉴定、用含有血管内皮细胞生长因子(10ng／m1)、碱性成纤维细胞生长因子(5ng／m1)的内皮细胞培养液进行诱导，诱导的细胞进行CD31免疫组化鉴定。骨髓间质干细胞诱导成的内皮细胞低密度(1x104／cm2)种植于脱细胞猪动脉支架，用DAPI法连续观察其生长情况，做细胞的生长曲线根据荧光显微镜观察结果；同时第n天对支架进行免疫荧光、冰冻切片、HE染色，扫描电镜观察,ELISA法检测培养液纤连蛋白的表达，收取细胞做RT-PCR检测纤连蛋白mRNA水平的变化。原代骨髓间质干细胞培养2周后，细胞融合成单层，梭形，排列有明显方向性，细胞排列成漩涡状、网状、辐射状；流式细胞术检测骨髓间质干细胞表面抗原结果显示HLA一2表达阳性、而CD34，CD45，HLADR及CDl4表达阴性；诱导成内皮细胞的免疫鉴定膜表面有蓝色阳性信号，CD31染色阳性。采用DAPI法连续动态观察内皮细胞在支架上生长良好，贴壁较好，间接反映细胞粘附力以及支架的生物相容性较好；冰冻切片的Ⅷ因子相关抗原(vWF)和CD31染色阳性，表面为一条连续的内皮细胞曲线：HE染色显示表面也形成连续融合单层细胞，未长入支架内部；扫描电镜观察内皮细胞单层形成，光滑均匀完整，细胞呈多角形，椭圆形，高低不平有一定的立体感。低密度种植的培养液中纤连蛋白的表达量较高密度种植的高，分别为121~7．93μg/106细胞和78．2~g~3．21／106细胞，有统计学差异(P<0．05)。RT-PCR结果也显示，低密度种植的内皮细胞的纤连蛋白mRNA水平较高密度种植高。内皮细胞低密度种植于脱细胞猪动脉支架不但可以使血管完全内皮化，而且有利于增强内皮细胞和细胞外基质粘附力，提高贴壁细胞的抗应切力。 本研究为组织血管工程支架的内皮化提供了一种新的、简便、可靠的观察方法，并通过骨髓间质细胞诱导成内皮细胞及其低密度种植来解决种子细胞来源和改善细胞的粘附力，对组织工程血管和瓣膜的成功构建具有重要意义。