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微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）是一种重要的人兽共患肠道寄生虫,可导致婴幼儿、新生动物和免疫缺陷个体的严重腹泻,甚至死亡。它是造成全球2岁以内儿童致死性腹泻的第二大病因,也是引起1月龄内犊牛腹泻的主要原因。目前被批准的可用于治疗隐孢子虫病的药物仅有硝唑尼特,但该药物在健康个体中仅有56%～96%的疗效,在免疫功能缺陷或婴幼儿个体中没有疗效,目前尚没有用于预防隐孢子虫感染的疫苗。环状RNA（circular RNA,circRNA）可在不同水平上调控基因的表达,参与各种生理和病理过程。研究显示,包括隐孢子虫在内的多种寄生虫感染可导致宿主circRNAs的显著差异表达,但关于这些显著差异表达circRNAs（differentially expressed circRNAs,DE circRNAs）的功能仍然未知。基于此,本研究利用微阵列芯片（microarray）技术检测了C.parvum感染24 h的HCT-8细胞中的circRNAs表达谱,筛选出DE circRNAs,应用实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）、过表达和干扰技术、免疫印迹（western blot）、双荧光素酶报告基因等试验方法,探究了circRNA在C.parvum感染HCT-8细胞中的调节作用及潜在的调控机制,获得了以下研究结果:1.获得了C.parvum感染的HCT-8细胞中的circRNAs表达谱:对C.parvum感染HCT-8细胞24 h的样品进行microarray分析发现,共有178个DE circRNAs[fold change（FC）＞2、P＜0.05],包括128个上调和50个下调的circRNAs;对DE circRNAs的来源基因进行GO富集分析,发现它们富集于重要的生物学过程和分子功能;对DE circRNAs的来源基因进行KEGG通路分析,发现它们富集于重要的信号通路,特别是代谢通路。2.发现上调表达的circRNA ciRS-7显著促进C.parvum在HCT-8细胞中的增殖:circRNA ciRS-7（hsa＿circ＿0001946＿CBC1,又称为CDR1as）在microarray结果中显著上调（FC=7.96530932、P＜0.05）;q RT-PCR分析发现,HCT-8细胞中ciRS-7的表达水平在感染后12 h（12 h post infection,12 h pi）～48 h pi显著升高;过表达ciRS-7显著促进感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平;而干扰ciRS-7表达的作用相反。3.获得了circRNA ciRS-7的潜在靶miRNAs:利用star Base v3.0预测到ciRS-7共有22个潜在的靶miRNAs;q RT-PCR分析发现,HCT-8细胞中miR-1270、miR-219a-5p、miR-135b-5p、miR-135a-5p、miR-139-3p、miR-601和miR-7的表达水平在24 h pi显著降低;过表达ciRS-7显著降低感染细胞中miR-1270、miR-219a-5p、miR-135b-5p、miR-135a-5p和miR-139-3p的表达水平,而干扰ciRS-7的表达显著升高感染细胞中miR-1270、miR-219a-5p、miR-135b-5p、miR-135a-5p和miR-7的表达水平;双荧光素酶报告基因试验发现,在HCT-8细胞中ciRS-7和miR-1270、miR-219a-5p以及miR-135a-5p存在结合作用。由此可见,在HCT-8细胞中,ciRS-7可靶向结合miR-1270、miR-219a-5p以及miR-135a-5p。4.发现circRNA ciRS-7靶向miR-1270调控NF-κB信号通路影响C.parvum在HCT-8细胞中的增殖:预测并证实了miR-1270和核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB,NF-κB）信号通路的亚基rel A（p65）基因的3’非翻译区（3’-untranslated region,3’-UTR）在HCT-8细胞中存在结合作用;HCT-8细胞中rel A基因的mRNA表达水平在12 h pi～48 h pi显著升高,且RELA蛋白质的表达水平在24 h pi显著升高,NF-κB信号通路下游因子nos2和cxlc2基因的mRNA表达水平在24 h pi也显著升高;转染miR-1270 mimics显著抑制感染细胞中rel A基因的mRNA和蛋白质表达水平以及nos2和cxlc2基因的mRNA表达水平,而miR-1270 inhibitor的作用相反;过表达ciRS-7显著促进感染细胞中rel A基因的mRNA和蛋白质表达水平以及nos2和cxlc2基因的mRNA表达水平,而干扰ciRS-7表达的作用相反;miR-1270 mimics逆转了过表达ciRS-7对感染细胞中的rel A以及nos2和cxlc2基因的mRNA表达水平的上调作用。进一步研究发现,miR-1270 mimics显著抑制感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平,而miR-1270 inhibitor的作用相反;miR-1270 mimics逆转了过表达ciRS-7对感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平的上调作用。5.发现circRNA ciRS-7靶向miR-135a-5p调控STAT1和p-STAT1的表达影响C.parvum在HCT-8细胞中的增殖:预测并证实了miR-135a-5p和信号传导及转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription1,stat1）基因的3’-UTR区在HCT-8细胞中存在结合作用;HCT-8细胞中stat1基因的mRNA表达水平在12 h pi～72 h pi显著上调,且STAT1和磷酸化STAT1（p-STAT1）的蛋白质表达水平在24 h pi显著上调;转染miR-135a-5p mimics显著抑制感染细胞中STAT1和p-STAT1的蛋白质表达水平,而miR-135a-5p inhibitor的作用相反;过表达ciRS-7显著促进感染细胞中STAT1和p-STAT1的蛋白质表达水平,而干扰ciRS-7表达的作用相反;miR-135a-5p mimics逆转了过表达ciRS-7对感染细胞中STAT1和p-STAT1蛋白质表达水平的上调作用。进一步研究发现,虽然miR-135a-5p mimics不影响感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平,但miR-135a-5p inhibitor显著上调了感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平;miR-135a-5p inhibitor逆转了干扰ciRS-7的表达时对感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平的下调作用。6.发现circRNA ciRS-7靶向miR-219a-5p调控细胞自噬影响C.parvum在HCT-8细胞中的增殖:HCT-8细胞中自噬关键蛋白LC3B-II和p62的蛋白质表达水平在8 h pi～48 h pi显著增加,表明C.parvum感染诱发了HCT-8细胞的不完全自噬;转染miR-219a-5p mimics显著增加了感染细胞中LC3B-II的蛋白质表达水平但降低了p62的蛋白质表达水平,而miR-219a-5p inhibitor的作用相反;过表达ciRS-7显著降低了感染细胞中LC3B-II的蛋白质表达水平但升高了p62的蛋白质表达水平,而干扰ciRS-7表达的作用相反;miR-219a-5p mimics逆转了过表达ciRS-7对感染细胞中LC3B-II蛋白质表达的抑制和p62蛋白质表达的促进作用;预测发现miR-219a-5p有16个与自噬通路相关的潜在靶基因,其中akt1、pik3ca和p62基因的mRNA表达水平在感染细胞中显著升高,但miR-219a-5p与akt1、pik3ca和p62基因在HCT-8细胞中均不存在结合作用,提示ciRS-7/miR-219a-5p轴可能通过其他机制调节C.parvum感染HCT-8细胞的自噬。进一步研究发现,miR-219a-5p mimics显著抑制了感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平,而miR-219a-5p inhibitor的作用相反;miR-219a-5p mimics逆转了过表达ciRS-7对感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平的上调作用。综上所述,C.parvum感染导致HCT-8细胞的circRNAs表达谱的显著改变,显著上调表达的circRNA ciRS-7可通过靶向miR-1270、miR-135a-5p和miR-219a-5p分别调控NF-κB信号通路、STAT1和p-STAT1的表达和细胞自噬来促进C.parvum在HCT-8细胞中的增殖。研究初步揭示了宿主circRNA ciRS-7在隐孢子虫感染中的作用,为进一步厘清隐孢子虫感染和致病机制提供了新思路。