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1.研究背景与目的:窖蛋白-1（Caveolin-1,Cln-1）,一个22kD的跨膜蛋白,是胞膜窖（Caveolae,Cle）组成中最重要的结构蛋白。Cln-1结构中的N-末端与C-末端都朝向细胞质[1],N-末端82-101位氨基酸残基形成窖蛋白“脚手架”结构域（CSD）,在Cln-1与众多胞内信号蛋白相互作用中起关键作用。Cln-1结构中另一个关键结构域是14位酪氨酸（Y14）,在对细胞刺激应答时,Y14发生磷酸化,Cln-1（pY14）的磷酸化对多种生物学过程都很重要,包括胞膜窖的内化和细胞信号的调节。Cln-1通过多条信号通路调节细胞的一些重要功能,包括细胞增殖、凋亡、分化及跨膜转运等。在肺脏,几乎各种类型的细胞中都富含Cln-1,包括Ⅰ型肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells type Ⅰ,AEC-Ⅰ）、内皮细胞、平滑肌细胞、纤维母细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等,而且Cln-1在急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）的发病中起重要作用。目前,尽管在通气策略等方面有一些改善,但ARDS仍是重症监护中重要的住院及死亡原因。对于ARDS的发病机理仍然了解的很少,治疗措施仍然非常有限。肺泡上皮屏障功能障碍发生在ARDS病理过程的早期阶段,且肺泡上皮细胞的损伤程度决定了 ARDS病人的伤情和预后,因此深入研究肺泡上皮细胞功能障碍的机制对于揭示ARDS的发病机制显得尤为重要。研究证实,Cln-1不仅在AEC-I细胞中表达丰富,而且在肺泡上皮屏障损伤中发挥了重要作用,但关于Cln-1参与ARDS肺泡上皮细胞损伤的具体调控机制未见报道。因此,本课题拟利用酵母双杂交技术,在人肺cDNA文库中筛选与Cln-1有相互作用的蛋白,并对有意义的阳性克隆在ARDS中的作用进行初步研究,以期通过探讨Cln-1在肺泡上皮细胞损伤中的调控来探索ARDS的发病机制,为阐明ARDS的发病机制提供新思路,并可能为将来ARDS的治疗提供新靶点。2.研究内容和方法:（1）小鼠Cln-1基因的克隆及诱饵载体构建:PCR法扩增Cln-1 cDNA全长基因序列,将其克隆至pSos酵母双杂交载体构建诱饵载体,并双酶切及测序鉴定。（2）Cln-1诱饵蛋白自激活检测:制备感受态酵母细胞并质量评价,将共转化质粒分别加到制备好的感受态细胞中,确定诱饵蛋白自激活特性并检测Cln-1诱饵蛋白表达。（3）Cln-1蛋白小鼠肺cDNA文库筛选及阳性克隆验证并测序。（4）免疫共沉淀技术（Co-IP）检测Cln-1蛋白与Axin-1在293T细胞中的相互作用及作用位点。（5）肺泡Ⅰ型上皮细胞分离、培养:PE标记的AEC-I细胞特异性抗体T1α标记细胞,采用抗PE的免疫磁珠阳性筛选AEC-I细胞。（6）Cln-1基因对LPS致炎AEC-I细胞的影响。LPS致炎AEC-I细胞及Cln-1-/-AEC-Ⅰ细胞,均给予LPS刺激,浓度10μg/ml,分2h和4h两个时相点。ELISA法测定LPS致炎细胞上清液的炎性因子TNF-α、IL-6表达水平。（7）Axin-1基因对LPS致炎AEC-I细胞的影响。AEC-I分为转染Axin-1 shRNA lentiviral particle实验组、转染空载体的对照组,均给予LPS刺激,浓度10μg/ml,分2 h和4 h两个时相点。ELISA法测定LPS致炎细胞上清液的炎性因子TNF-α、IL-6表达水平。（8）同时敲除Cln-1并沉默Axin-1表达对LPS致炎AEC-I细胞的影响:Axin-1 shRNA lentiviral particle 转染 Cln-1-/-AEC-I 细胞,给予 LPS 刺激,测定 LPS 致炎细胞上清液的炎性因子TNF-α、IL-6表达水平。（9）CRISPR/Cas9技术敲除Cln-1与Axin-1相互作用位点对LPS致炎AEC-I细胞的影响。（10）Cln-1与Axin-1相互作用对LPS致炎AEC-I细胞的作用机制。3.研究结果:（1）PCR成功扩增出Cln-1 cDNA全长序列,并将其克隆至pSos载体,经酶切及测序鉴定正确无误。（2）Cln-1诱饵蛋白无自激活活性,适合酵母双杂交筛选,并检测到Cln-1诱饵蛋白表达。（3）经酵母双杂交实验筛选到6个阳性克隆,经测序分别是:Mus musculus eukaryotic translation elongation factor 2（Eef 2）,mRNA;Mus musculus Axin-1（Axin-1）,transcript variant 2,mRNA;Mus musculus ferritin heavy chain 1（Fth 1）,mRNA;Mus musculus proteasome（prosome,macropain）26S subunit,ATPase,4（Psmc 4）,mRNA;Mus musculus 5-azacytidine induced gene 2（Azi 2）,transcript variant 1,mRNA;Mus musculus mitogen-activated protein kinase kinase 2（Map 2k 2）,mRNA。（4）Co-IP证实Cln-1与Axin-1在293T细胞中存在相互作用,作用位点位于Cln-1的 1-100aa 和 Axin-1 的 710-797aa。（5）成功培养原代肺泡I型上皮细胞,纯度可达95%左右,细胞总量为3× 106/ml。（6）LPS 刺激 AEC-Ⅰ 细胞,Axin-1 mRNA 表达显著上升。Axin-1 shRNA 转染 AEC-Ⅰ细胞后,给予LPS刺激,实验组细胞TNF-α、IL-6的分泌水平显著降低。（7）Cln-1敲除后,Axin-1表达下调,给予LPS刺激后,实验组细胞上清液TNF-α、IL-6分泌水平显著降低。（8）Axin-1 shRNA转染Cln-1-/-AEC-Ⅰ细胞,给予LPS刺激后,实验组AEC-Ⅰ细胞上清液炎性因子的分泌水平更低,P＜0.05。（9）CRISPR/Cas9技术敲除Cln-1和Axin-1的结合位点,给予LPS刺激后,实验组AEC-I细胞上清液炎性因子的分泌水平显著升高。（10）Axin-1沉默组或Cln-1-/-组AEC-I细胞在2 h、4 h时相点β-catenin表达显著高于对照组,而在同时敲除Cln-1并沉默Axin-1表达组AEC-I细胞β-catenin表达更高,P＜0.05。在CRISPR/Cas9技术敲除Cln-1和Axin-1的结合位点后,β-catenin表达水平明显降低。4.结论:（1）经酵母双杂交实验筛选到Cln-1相互作用蛋白6种,免疫共沉淀实验验证了Cln-1与Axin-1的相互作用及作用位点。（2）成功培养肺泡Ⅰ型上皮细胞并下调Axin-1表达。（3）下调Cln-1或者Axin-1表达后,LPS诱导小鼠AEC-I细胞损伤减轻,同时敲除Cln-1并沉默Axin-1表达后,AEC-I细胞炎性反应更轻。（4）Cln-1和Axin-1相互作用影响LPS诱导小鼠AEC-I细胞炎性反应,敲除Cln-1和Axin-1结合位点后,加重LPS诱导的AEC-I细胞炎性反应,此效应与β-catenin信号转导途径有关。