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细胞壁是由多糖等物质组成的复杂网状结构,其在植物生长发育、机械支撑、物质运输及胁迫反应等方面具有重要作用。同时细胞壁提供了人们食物中主要的膳食纤维及造纸、纺织及木材的基本原材料。虽然前人对细胞壁进行了大量研究,但是对其合成及沉积机制还不很清楚。
本文从水稻(Oryza sativa)中花8号转基因组培苗中分离出一个突变体,其主要表型为茎秆、叶片、穗等组织机械强度降低、易折断;同时,还表现出比野生型稍矮、披叶等特点。我们将此突变体命名为bcz。遗传学分析表明,突变由单隐性基因控制,且与已经报道的水稻脆秆突变体bcl、OsCesA7不等位,推测它是一个新突变体。扫描电镜的结果显示,bcz厚壁细胞变薄、层数减少。细胞壁化学成分定量分析表明:bcz的纤维素含量减少,木质素含量增加;单糖成分中的葡萄糖含量显著降低,而木糖含量显著升高。
对转化子的检测表明:bcz突变表型与转基因的T-DNA插入无关;使用修饰的Sitefinding-PCR方法对Tos17的侧翼序列进行了分析,结果显示突变表型与Tos17转座插入无关。使用图位克隆的方法对BCZ基因进行了定位,从总株为1619株的bcz/TN1 F2群体中挑出375个突变个体作为定位群体。首先利用混池法筛选可用的分子标记,将基因初定位于9号染色体;最终把基因精细定位于相距114 kb的两个标记WM-4与WM-8之间。
该区间共有17个预测的开放阅读框,7个阅读框有功能注释,其中Os09g32080编码一个推测的内源几丁质酶A2前体,与拟南芥的AtCTL1基因有高度的相似性,因此将它命名为OsCTL1基因;已知AtCTL1与细胞壁合成有关。从野生型和突变体中克隆了OsCTL1和Osctl1基因,测序结果显示:Osctl1基因编码区的639位(位于第三个外显子)GCG突变为TTG,导致编码蛋白质产生了一个错义突变,第213位的丙氨酸突变为亮氨酸,已知该位点在物种中是十分保守的。OsCTL1基因能够互补bcz突变体的表型,因此OsCTL1就是BCZ基因。
本论文还对OsCTL1的表达模式进行了分析,定量PCR结果表明:OsCTL1在所检测的抽穗开花期叶片、茎秆、叶鞘、幼穗中都有表达;其中在茎秆和幼穗中优势表达。另外,发现OsCTL1和Osctl1存在大量剪接异构体。采用农杆菌注射法使OsCTL1-GFP融合蛋白分别与高尔基体标志Man49-RFP融合蛋白、内质网定位标志RFP-HDEL融合蛋白在烟草(N.benthamiana)中共表达,结果表明:OsCTL1蛋白定位于质膜、核膜及高尔基体分泌囊泡;而且该类囊泡沿着质膜运动,参与了胞质环流。使用PEG-CaCl2介导法转化水稻原生质体也证明OsCTL1-GFP定位于质膜。
对OsCTL1蛋白质二级及三级结构分析表明,突变体中OsCTL1蛋白质的保守几丁质糖苷水解酶19结构域发生了明显改变,可能导致其酶活性丧失,引起组成细胞壁的纤维素含量减少,而产生了脆秆表型。bcz是一个新的脆秆突变体,因此本文为水稻细胞壁的合成机制研究提供了新线索。