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仔猪腹泻是养猪生产中普遍存在的肠道感染性疾病,严重影响养猪业的健康发展。C型产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens type C,C.perfringens type C）是引起幼龄仔猪腹泻的常见细菌性病原菌之一,其主要通过产生α和β毒素,损坏仔猪肠道健康,引起仔猪腹泻。近年来,尽管商品化的疫苗和抗生素类药物在一定程度上能够预防和治疗仔猪腹泻,但随着绿色无抗养殖的呼吁,对仔猪腹泻的防治方法提出了新的挑战。因此,从遗传学角度,开展抗病育种相关研究,成为防治仔猪腹泻的重要手段。Micro RNAs（miRNAs）是一类长度约22nt的非编码小RNA分子,其能够在转录或转录后水平调控基因表达,参与多种生物学过程的调控。本课题组前期建立了7日龄长×大二元仔猪感染C型产气荚膜梭菌耐受（IR）和易感（IS）个体,通过高通量测序技术对仔猪回肠组织进行Small RNA测序,发现ssc-miR-204在耐受组和易感组之间显著差异表达,且在易感组高表达,推测其可能在仔猪C型产气荚膜梭菌感染过程中发挥重要调控作用。鉴于此,本研究以miR-204为研究对象,用产气荚膜梭菌β2毒素（Clostridium perfringens beta2,CPB2）处理猪小肠上皮细胞（intestinal porcine epithelial cells,IPEC-J2）,通过qRT-PCR、Western Blot、CCK-8、Ed U染色、流式细胞术、乳酸脱氢酶（LDH）活性检测、双荧光素酶报告基因试验、过表达和RNA干扰等试验技术,初步探索miR-204/BCL2L2调控轴在仔猪感染C型产气荚膜梭菌中的调控作用。主要研究结果如下:1.miR-204表达模式及功能研究:miR-204在仔猪感染C型产气荚膜梭菌易感组回肠组织中极显著上调表达（P<0.01）;组织表达谱结果显示,miR-204在仔猪肾脏、肝脏、胸腺、淋巴和回肠等组织中显著高表达;CPB2毒素处理IPEC-J2细胞后,miR-204也呈不同程度的上调表达。相比于阴性对照组,miR-204 mimic能够抑制IPEC-J2细胞增殖,促进凋亡,增加LDH活性,增加促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β的表达,同时下调Bcl2蛋白表达而上调Bax蛋白表达。2.miR-204生物信息学分析及靶向BCL2L2基因关系验证:采用Target Scan、miRDB和Pic Tar 3款软件对miR-204进行靶基因预测,得到共同靶基因有114个;miR-204靶基因能够显著富集在15个GO功能和13个KEGG信号通络。生物信息学预测发现miR-204成熟体种子区序列与BCL2L2基因3’UTR区存在结合位点。双荧光素酶活性检测证实miR-204能够直接靶向结合BCL2L2基因。进一步通过qRT-PCR和Western Blot检测发现,miR-204可以负调控BCL2L2的表达。3.miR-204通过靶向BCL2L2参与CPB2毒素诱导的细胞凋亡和炎症反应:首先分析了BCL2L2基因敲低和过表达对CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞凋亡和炎症反应的影响。结果表明,敲低BCL2L2后,促进了IPEC-J2细胞凋亡,增加LDH活性和炎性因子的表达;而过表达BCL2L2后,则表现出相反的表达趋势。此外,将pcDNA3.1、pcDNA-BCL2L2与miR-204 mimic共转染,发现过表达BCL2L2后,减弱了miR-204mimic引起的细胞凋亡和炎症反应。综上所述,CPB2毒素处理IPEC-J2细胞后,上调表达的miR-204通过直接靶向BCL2L2促进CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞凋亡和炎症反应。miR-204及其靶基因可能在仔猪感染C型产气荚膜梭菌导致腹泻的过程中发挥重要作用,本研究结果可为miRNAs参与调控C型产气荚膜梭菌性仔猪腹泻的作用机制提供依据。