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肝纤维化是世界范围内的健康问题,目前还没有有效的治疗方法。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)在肝纤维化的过程中扮演了重要角色,在过去的二十年中,通过研究HSC来探讨肝纤维化已成为一种重要趋势。随着肝脏损伤,HSC被激活并增殖,进而产生以Ⅰ型胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)。HSC最初的变化是发生在窦周间隙内的ECM内,随着时间的进展,内皮细胞下的ECM发生变化。最初ECM主要由Ⅳ型胶原、类肝素硫酸蛋白聚糖和层粘连蛋白组成,其中层粘连蛋白是基底膜的组成部分。随后,ECM变的富含纤维蛋白成分,特别是Ⅰ型和Ⅲ型胶原。Raf/细胞外信号调节激酶(Extracellular regulated kinase, ERK)和局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase , FAK)-磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt/核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(70-kDa ribosomal S6 kinase,p70S6K)信号通路调节增殖相关基因的转录、蛋白的分泌、细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡。血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)刺激肝星状细胞,激活FAK,进而激活PI3K。内源性大麻素系统包括大麻素受体、大麻素系统配体和调节大麻素受体和配体相关蛋白。已经克隆和鉴别出两个大麻素受体,即大麻素受体1(cannabinoid receptor type 1,CB1)和大麻素受体2(cannabinoid receptor type 2,CB2)。利莫那班是第一个被开发出的CB1特异性阻断剂,并且是口服的。通过动物体内试验和体外细胞试验发现内源性大麻素系统可以通过调节重要的细胞信号通路而调节肿瘤细胞的生长。也有实验研究发现内源性大麻素系统在肝纤维化的形成过程中扮演着重要角色。在用四氯化碳注射制造肝纤维化的模型中,大麻素受体2基因敲除小鼠更易发展形成纤维化,而在大麻素受体1敲除的小鼠中,肝纤维化的形成较轻。目前,已经有许多关于CB1和肝纤维化的研究,然而,CB1拮抗剂利莫那班对体外肝星状细胞的影响及其机制还没有研究,如利莫那班对HSC增殖的影响,凋亡的影响和胶原的影响。目的:我们探讨利莫那班对HSC-T6细胞和原代HSC增殖的影响,探讨利莫那班对HSC-T6细胞凋亡和胶原分泌的影响,我们还通过在10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)刺激HSC的情况下研究利莫那班的影响。我们进一步研究利莫那班对HSC影响的机制,及是否通过抑制ERK和FAK的磷酸化产生的这些影响。方法:细胞增殖行MTT分析。通过实时荧光定量PCR检测CB1、ERK和FAK mRNA的表达,通过Western blot方法分析ERK、p-ERK、FAK和p-FAK蛋白的表达。通过流式细胞术和透射电镜技术检测细胞凋亡、Caspase-3蛋白表达和细胞周期。通过MTT技术检测Caspase-3蛋白活性。透明质酸(hyaluronic acid,HA)、层粘连蛋白(laminim,LN)、Ⅲ型前胶原(procollagen type III,PCIII)和Ⅳ型胶原(type IV collagen,collagen IV)是通过放射免疫方法检测。结果:1利莫那班阻断HSC-T6细胞和原代HSC的增殖并且有剂量依赖性。和对照组相比,利莫那班(5,10和20μM)组HSC-T6细胞和原代HSC的细胞活性明显降低(HSC-T6细胞,0.86±0.06,0.79±0.13,0.20±0.04 vs 1.00±0.00,原代HSC,0.83±0.13,0.67±0.09,0.62±0.10 vs 1.00±0.00,P < 0.05,n=3)。在10%FBS刺激的利莫那班(5,10和20μM)组和10%FBS刺激的空白对照组,也可发现HSC-T6细胞和原代HSC的细胞活性明显降低。在利莫那班(5,10和20μM)组HSC-T6细胞和空白对照组相比,均干预12小时,G2/M期细胞数下降同时G0/G1期细胞数增加(G2/M期细胞数,34.33%±7.82%,21.33%±7.07%,20.13%±0.99% vs 40.57%±5.48%,G0/G1期细胞数,50.80%±3.13%,62.70%±0.95%,67.60%±0.70% vs 45.33%±2.51%,P<0.05,n=3)。在用10μM利莫那班处理6,24,48小时的各组细胞和空白对照组相比,G2/M期细胞数下降同时G0/G1期细胞数增加(G2/M期细胞数,22.57%±0.86%,9.40%±1.77%,6.70%±5.03% vs 29.03%±5.87%,G0/G1期细胞数, 51.97%±1.53% ,66.93%±2.59%,70.67%±1.60% vs 49.33%±2.36%,P<0.05,n=3)。在用10%FBS刺激的利莫那班(20μM)组和10%FBS刺激的空白对照组相比,G2/M期细胞数明显下降(23.47%±6.06% vs 32.60%±5.60%,P<0.05,n=3)。2在利莫那班(20μM)组和用10%FBS刺激的利莫那班(20μM)组中,用透射电镜可观察到,萎缩的染色质向细胞核的核膜浓缩和聚集。细胞核内出现新月体形和圆形染色质,在这些凋亡的细胞上我们看到内质网肿大、细胞表面微绒毛消失、线粒体肿胀、核膜褶皱和肿胀。所测HSC-T6细胞凋亡率,在空白对照组为22.67%±0.47%,在利莫那班(5,10和20μM)组凋亡率分别增加到24.33%±1.21%,27.80%±0.90%,35.70%±0.90%。在用10μM利莫那班处理6,24,48小时的各组细胞和空白对照组相比,细胞凋亡率明显上升。在用10%FBS刺激的利莫那班(20μM)组和10%FBS刺激的空白对照组相比细胞凋亡率也明显上升。HSC-T6细胞Caspase-3蛋白表达方面,各组都干预12小时,利莫那班(5,10和20μM)组和空白对照组相比分别增加了34.78%,88.83%,143.45%。同样,在用10μM利莫那班处理6,24,48小时的各组细胞和空白对照组相比,Caspase-3蛋白表达分别增加了33.33%,112.50%,220.83%。在用10%FBS刺激的利莫那班(20μM)组和10%FBS刺激的空白对照组相比Caspase-3蛋白表达也明显上升。利莫那班(5,10和20μM)组和空白对照组相比,Caspase-3蛋白酶活性有一个浓度依赖性的上升。3在利莫那班(5,10和20μM)组和空白对照组相比,各组均干预12小时,HSC-T6细胞HA、PC III、collagen IV和LN分泌均有下降。在用10μM利莫那班处理24,48小时的各组细胞和空白对照组相比,HSC-T6细胞HA、PC III、collagen IV和LN分泌均有下降。在用10%FBS刺激的利莫那班(20μM)组和10%FBS刺激的空白对照组相比,HSC-T6细胞HA、PC III、collagen IV和LN分泌也明显下降。4在利莫那班(5,10和20μM)组和空白对照组相比,各组均干预12小时,HSC-T6细胞CB1 mRNA表达明显下降(0.70±0.60,0.68±0.07,0.19±0.03 vs 1.00±0.00,P<0.05,n=3)。用20μM利莫那班干预的HSC-T6细胞CB1 mRNA表达下降最明显。在用10μM利莫那班处理24,48小时的各组细胞和空白对照组相比,HSC-T6细胞CB1 mRNA表达明显下降(0.65±0.04,0.58±0.22 vs 1.00±0.00,P<0.05,n=3)。在用10%FBS刺激的利莫那班(20μM)组和10%FBS刺激的空白对照组相比,HSC-T6细胞CB1 mRNA表达也明显下降(0.35±0.05 vs 1.20±0.14,P<0.05,n=3)。在用利莫那班干预的各组和空白对照组相比,ERK和FAK mRNA表达无明显变化。在利莫那班(10和20μM)组和空白对照组相比,各组均干预12小时,ERK和FAK蛋白磷酸化水平均下降,最明显的下降在利莫那班(20μM)组。在用10μM利莫那班处理24,48小时的各组细胞和空白对照组相比,ERK和FAK蛋白磷酸化水平均下降。在用利莫那班干预的各组和空白对照组相比,总ERK和FAK蛋白表达无明显变化。在用10%FBS刺激的利莫那班(20μM)组和10%FBS刺激的空白对照组相比,ERK和FAK蛋白磷酸化水平下降。结论:利莫那班通过抑制ERK和FAK蛋白磷酸化和下调CB1 mRNA水平,抑制HSC的增殖和ECM的表达同时促进HSC的凋亡,当细胞用10%FBS刺激后仍可见上述变化。