溶瘤病毒疗法已经成为肿瘤免疫治疗中重要的一部分。溶瘤病毒可以通过在肿瘤细胞中复制、增殖并裂解肿瘤细胞,释放的子代病毒颗粒感染周围的肿瘤细胞,破坏肿瘤细胞,同时通过释放肿瘤相关抗原,诱导全身及局部抗肿瘤免疫应答,激活免疫细胞对肿瘤的杀伤作用。目前溶瘤病毒的研究中,腺病毒由于具有转基因效率高、外源基因容量大、安全性好等优点,在临床研究中备受青睐。溶瘤腺病毒除了可以在肿瘤中发挥自身的溶瘤作用外,也可通过基因工程手段使溶瘤腺病毒携载不同的外源基因,提高溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的杀伤、靶向和免疫调节等功能。针对于不同的肿瘤特性,改造溶瘤腺病毒使其携载不同的免疫调节基因或联合其它免疫治疗策略,在发挥溶瘤腺病毒溶瘤作用的基础上,进一步激活和促进抗肿瘤免疫反应,将抗肿瘤作用发挥到最大化,有望最终达到消除肿瘤的目的。课题组在前期研究中,设计并构建了一种新型溶瘤腺病毒r Ad5-z TRAIL-RFP-Δ24E1A（CRAd5-TRAIL）,可以在肿瘤细胞中特异性复制的同时表达肿瘤坏死因子凋亡诱导配体蛋白（TRAIL）,通过与肿瘤细胞表面表达的死亡受体结合,诱导肿瘤细胞凋亡。我们在前期研究中分别评价了CRAd5-TRAIL在人乳腺癌、胶质瘤以及急性髓系白血病中的治疗效果,发现无论在实体瘤还是非实体瘤中都能够有效的抑制肿瘤生长,显示出了良好的应用前景。为了进一步推进CRAd5-TRAIL在肿瘤免疫疗法中的应用,其在肿瘤中发挥的抗肿瘤免疫机制的研究就成为了我们的研究重点。然而,由于人源腺病毒在鼠肿瘤细胞中的复制能力受到一定限制导致缺乏理想的动物模型,目前对于溶瘤腺病毒具体的抗肿瘤免疫机制是不清晰的。另外,近期的研究表明,TRAIL除了能够选择性的诱导肿瘤细胞凋亡,还可以通过调节肿瘤微环境中的免疫抑制细胞影响肿瘤的生长。因此,CRAd5-TRAIL在发挥溶瘤病毒本身裂解肿瘤细胞作用和诱导肿瘤细胞凋亡的同时,是否具有调节肿瘤免疫微环境的功能,在抗肿瘤免疫响应中发挥怎样的作用,以及具体的机制是怎样的,仍需更深入的研究。而在明确其抗肿瘤免疫机制的基础上,还可通过联合其它免疫治疗策略进一步增强溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用。为了选择合适的鼠肿瘤细胞系来评价CRAd5-TRAIL的抗肿瘤免疫作用和机制,我们首先在体外评价了CRAd5-TRAIL在多种小鼠肿瘤细胞中的感染性质、复制水平、肿瘤细胞杀伤活性以及诱导细胞凋亡的能力。由于人腺病毒在小鼠肿瘤细胞中呈低水平的复制,我们尝试构建了稳转L4-100K的小鼠乳腺癌细胞系4T1-100K,以提升CRAd5-TRAIL的复制能力,但结果并不理想。随后,根据CRAd5-TRAIL对不同细胞杀伤能力的区别,我们选择了杀伤效果较好的B16细胞,以及杀伤效果相对弱的CT26细胞,这两类细胞作为后续体内实验的主要研究目标。在CT26和B16两种皮下荷瘤模型中分别对CRAd5-TRAIL在体内的抗肿瘤效果以及抗肿瘤机制进行了分析,结果发现CRAd5-TRAIL在CT26和B16小鼠模型的治疗中均具有一定的抗肿瘤活性。同时我们发现CRAd5-TRAIL能够在CT26和B16模型中诱导较强的细胞凋亡,这说明治疗中所体现的抗肿瘤效果,主要由TRAIL的凋亡作用引发的。通过对小鼠肿瘤组织中腺病毒蛋白m RNA的检测,发现病毒的复制水平是存在一定程度的限制,导致病毒不能在肿瘤早期大量复制,这也是影响抗肿瘤效果的因素之一。对肿瘤组织内免疫细胞进行分析发现,CRAd5-TRAIL能够增加CT26模型瘤内浸润的CD8+T细胞的数量,同时能够增加B16模型中瘤内激活的CD4+和CD8+T细胞的比例,这在一定程度上利于对肿瘤细胞的杀伤,抑制肿瘤的生长。此外,两种肿瘤模型的瘤内免疫抑制细胞Tregs的数量在经过溶瘤腺病毒治疗之后均显著地下降,同时TRAIL并不影响腺病毒对Tregs细胞的降低作用,但具体的免疫分子机制仍不清楚。这些结果表明,尽管CRAd5-TRAIL在免疫全能鼠模型上仍具有抗肿瘤活性,但其对肿瘤免疫微环境内免疫细胞的激活能力有限,也在一定程度上限制了免疫治疗的效果。CD40L作为一种免疫激活分子,可以与多种免疫细胞作用,CD40L/CD40相互作用已被证明可以促进DCs成熟,为B细胞提供增殖或分化信号,刺激Th1型免疫反应,并促进T细胞的活化、细胞毒性和迁移到肿瘤微环境中。目前,表达CD40L的腺病毒基因治疗载体（Ad5-CD40L）在肿瘤免疫治疗的临床研究中也发挥了积极的作用。因此,将CRAd5-TRAIL与Ad5-CD40L进行联合治疗有望通过对肿瘤微环境进行重塑,进一步提高肿瘤免疫治疗的效果。联合治疗中,一方面溶瘤腺病毒通过高效杀伤肿瘤细胞释放更多的肿瘤抗原,另一方面,CD40L通过激活更多的免疫细胞提升抗肿瘤免疫,因而可以相互促进更加有效地抑制肿瘤生长。我们通过体外实验分析发现,Ad5-CD40L可以上调多种肿瘤细胞表面TRAIL受体（TRAILR）的表达,因而促进了CRAd5-TRAIL的凋亡作用。同时,Ad5-CD40L感染小鼠肿瘤细胞后的裂解产物还可以激活DCs和小鼠原代B细胞,且在一些细胞中联合作用后这种激活作用得到了提升。之后,在体内对CRAd5-TRAIL和Ad5-CD40L联合治疗的抗肿瘤效果和免疫机制进行评价,我们进一步分析了CT26和B16两种模型中瘤内T细胞、TAMs、MDSCs、Tregs、B细胞、DC细胞和NK细胞的变化,同时通过ELISPOT实验对于小鼠T细胞响应和B细胞响应进行分析,并检测小鼠体内肿瘤特异性抗体的浓度,血清中和瘤内细胞因子表达水平,从多角度对联合治疗的抗肿瘤机制做出评价。结果表明,在CT26和B16中瘤内肿瘤细胞发生了明显的凋亡现象,说明在联合治疗中凋亡作用对肿瘤的生长有着强有力的抑制效果。同时CRAd5-TRAIL和Ad5-CD40L的联合治疗能够显著增强T细胞、B细胞和DC细胞的浸润和激活水平,降低瘤内Tregs的浸润数量,上调肿瘤细胞表面的TRAILR表达,产生针对肿瘤的特异性T细胞反应和抗体,并产生利于抗肿瘤响应的细胞因子,有助于产生更强的抗肿瘤免疫反应。总之,CRAd5-TRAIL和Ad5-CD40L的联合治疗能够通过调节肿瘤免疫微环境更好的发挥抗肿瘤免疫的作用。综上所述,本论文对携载TRAIL的溶瘤腺病毒在两种小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤效果和抗肿瘤免疫机制进行了分析,并通过与表达CD40L的腺病毒载体联用,增强了瘤内及全身性的抗肿瘤免疫响应,提升了对肿瘤的治疗效果。联合治疗的机制包括:溶瘤腺病毒在肿瘤中复制裂解肿瘤细胞,同时表达TRAIL治疗基因对肿瘤细胞进行杀伤,CD40L在促进TRAIL凋亡作用的同时发挥调节肿瘤微环境免疫响应的作用,使联合治疗达到一个更好的溶瘤免疫治疗效果。在多种方式联合治疗已经成为肿瘤治疗策略新趋势的今天,这种基于溶瘤腺病毒的联合病毒疗法,为未来肿瘤免疫治疗提供了新的思路。