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目的艾滋病痴呆综合征(ADC)是艾滋病中最常见的神经系统并发症,一般晚期HIV感染者易患此病,是由人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)侵犯中枢神经系统(CNS)造成病人意识、行为和运动功能改变为主要表现的综合征。迄今为止,ADC的具体发病机制尚不清楚,但有多项研究证明HIV不能直接感染神经元,而是通过感染脑组织内的巨噬细胞和小胶质细胞,引发炎症反应释放细胞因子及自由基,最终损伤大脑神经元。HIV感染可使人神经胶质细胞表达肿瘤坏死因子-α(TNF-a)和白细胞介素(IL)等多种具有潜在神经毒性作用的细胞因子,其中TNF-α、IL-1β是ADC发病过程中最重要的两种,它们能提高血脑屏障的通透性以利于HIV-1感染的单核-巨噬细胞侵入大脑,增强病毒复制,还能与趋化因子共同作用扩大炎症反应,损害神经元。HIV-1的早期基因负调控因子(Nef)是HIV-1调节蛋白之一,能够下调病毒转录,延长病毒寿命,增强病毒的复制能力和感染性,并干扰生长因子介导的与增殖、分化和凋亡有关的信号通路,促进艾滋病病情的进展。HIV-1为逆转录病毒,具有高度的变异性,而HIV-1基因的变异很有可能与ADC的发病机制相关。为了探讨ADC患者体内]HIV-1nef基因的变异,以及这种变异所引起的氨基酸位点改变及其与ADC之间的关系等,本论文对一例ADC病人的CNS和外周共5个部位来源的25株HIV-1nef全序列进行了基因多样性分析,并研究了nef基因变异导致的氨基酸位点的改变以及对U87细胞分泌TNF-α,IL-1β的影响,为探讨ADC的发病机制提供思路。方法1.提取1例ADC病例尸检标本的CNS(基底核、额叶灰质、脑膜、颞叶)和外周(脾)的共5个部位组织中的基因组DNA并以其为模板,PCR扩增HIV-1nef基因全序列,PCR产物连接到pMD19-T克隆载体后转化至大肠杆菌DH5α,经氨苄青霉素及蓝白班筛选挑取阳性菌落增菌后测序,序列经BLAST分析后,每个部位取5个HIV-1nef序列,利用Bioedit、MEGA4等生物学软件进行基因距离、系统进化树、同义／非同义替换值(ds/dn)以及氨基酸位点变异等分析。2.根据序列分析结果选取CNS和外周来源的基因变异较大的HIV-1nef阳性克隆各一株(共5株),将这5株阳性克隆以及本室保存的pcDNA3.1穿梭载体增菌后凝胶回收,并进行双酶切,回收鉴定后以T4连接酶将经过双酶切的nef和pcDNA3.1连接,转化至大肠杆菌DH5α,经氨苄青霉素及蓝白斑筛选出重组pcDNA3.1-nef真核表达载体,用双酶切鉴定证实。然后将重组pcDNA3.1-nef真核表达载体经脂质体法转染至U87细胞中,培养22～62h后经免疫组化法及western-blot检测Nef表达情况,并收集上清,ELISA法测定U87细胞上清中TNF-α、IL-1β的含量,SPSS软件对数据进行统计学处理。结果1.成功克隆了一例ADC病人CNS和外周共5个部位来源的25株]HIV-1nef基因,经测序BLAST分析证实均为HIV-1nef基因序列,并证明了该ADC患者感染的是HIV-1B亚型。与标准序列HXB2比较,通过系统发育树发现,CNS和外周的nef基因序列位于进化树中不同的进化枝上,表明该ADC患者体nef基因序列在CNS和外周中存在的核苷酸变异不同,而CNS不同部位的nef基因序列大多位于不同的进化枝上,且个别序列之间存在交叉现象,表明在中枢神经系统中不同部位的nef基因所存在的变异也不尽相同,由此说明HIV-1nef存在基因多样性,且可能在进化的过程中受到区室化作用影响,并存在迁移现象。而由组间基因距离分析可以看出,相同组织来源的nef序列基因距离较小,而CNS和外周的nef基因距离差异较大,可见不同的机体环境对基因变异也具有一定选择作用。2.通过对ds/dn值的研究发现,该ADC病例所有HIV-1nef基因序列的ds/dn=2.3241±1.7529,外周组织的HIV-1nef基因序列的ds/dn=3.1809±1.1119,CNS的HIV-1nef基因序列的ds/dn=1.7924±1.2213, ds/dn均大于1(P<0.05)。表明CNS和外周的HIV-1nef基因变异均受到负向选择压力,病毒自身变异起主要作用,同时机体倾向于清除有害的非同义突变。3.氨基酸位点分析结果显示,该ADC病例CNS和外周的Nef氨基酸变异位点及频率均不同,有些氨基酸位点变异在CNS和外周都有发生,有些位点变异只发生在CNS,有些位点变异只发生在外周。4.成功构建HIV-1nef基因的重组pcDNA3.1-nef真核表达载体,脂质体法转染至U87细胞中,培养36～48h后免疫组化法检测Nef蛋白表达情况,于细胞内均可见到棕色颗粒沉淀,western-blot亦可检测到目的蛋白的表达,说明重组pcDNA3.1-nef真核表达载体质粒转染成功,并在U87细胞内特异性表达。5.ELISA检测细胞上清中细胞因子含量,结果显示,未转染重组pcDNA3.1-nef真核表达载体的U87细胞上清的空白对照组与仅加入转染试剂及仅加入pcDNA3.1质粒的对照组相比,TNF-α、IL-1β的含量差异无统计学意义(P>0.05),说明转染试剂及pcDNA3.1质粒均对U87细胞分泌TNF-α、IL-1β水平没有影响；与空白对照组相比,Nef蛋白实验组U87细胞上清中TNF-α、IL-1β的含量均有显著升高(P<0.05),说明Nef蛋白能诱导并增强U87细胞分泌TNF-α、IL-1β,但CNS来源与外周组织来源的Nef蛋白对U87细胞TNF-α及IL-1p的分泌量的影响没有明显的差异(P>0.05)。结论1.ADC患者不同组织部位nef基因变异不同,其变异同时受到自身变异和环境选择双重作用,其中病毒自身变异起主要作用,同时机体倾向于清除有害的非同义突变。2.不同组织部位Nef氨基酸变异不同,对Nef蛋白产生的影响亦不相同,可能导致Nef蛋白某些功能的改变,影响HIV-1在ADC患者体内的复制、感染、凋亡等,可能与ADC发病机制有一定联系,需进一步研究。3. HIV Nef蛋白能诱导并增强人神经胶质细胞U87分泌TNF-α、IL-1β的能力。