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前言 多发性骨骺发育不良（MED）是一种少见的遗传性骨软骨发育不良疾病，它是由于软骨细胞外基质中的结构蛋白及细胞膜转运蛋白等缺陷引起的全身性的骨骺发育异常，其遗传方式和临床表现都具有异质性。遗传方式以外显完全的常染色体显性遗传为主，少数病例为隐性遗传。根据临床表型可分为轻型（Ribbing型）、重型（Fairbank型）和未分类型，三型间没有明确的区分标准。典型的表现是轻到中度身材矮小或正常和早期发作的骨关节炎，儿童早期即出现大关节疼痛、僵硬，步态蹒跚，逐渐形成手指短粗，膝内外翻等畸形，30％的患儿可有股骨头坏死。国外对MED的研究已深入至分子水平，早在1994年MED的致病基因之一已被定位于19p13.1。随后，Briggs MD等发现位于该区的COMP基因突变可引起MED。以后陆续发现了其它3个MED的致病基因，分别是编码Ⅸ型胶原蛋白α2链的COL9A2基因，α3链的COL9A3基因，以及畸形发育不良硫酸盐转移因子（DTDST）基因。其中前三者的突变均导致显性遗传的MED，后者与隐性遗传的MED相关。COMP基因突变最常见，国外报道的MED患者中COMP基因突变占57％以上。COMP基因长约26Kb，含有19个外显子。目前国外MED患者中已发现了9种点突变以及1种插入性突变和1种缺失性突变，分布在从第9到第16外显子之间的6个外显子上，其中外显子10突变发生率较高。国内尚无该病的分子遗传学研究的报道。 本研究采用聚合酶链反应—单链构象多态性（PCR-SSCP）技术结合DNA测序方法，对10例临床诊断MED的患者及10名父母和30例正常人进行COMP基因第10，13和14外显子突变检测和分析，初步探讨我国多发性骨髓发育不良（MED）病例中软骨寡聚物基质蛋白（COMP）基因突变的情况。 实验材料 二．受试对象 实验组：8例散发患儿及一个具有家族史的家系的2名患者(先证者及其母入散发患者的父母10名，临床表型正常。 对照组：无亲缘关系的正常儿童30名。 2．试剂及实验设备 试剂： PCR引物由上海赛尔公司合成；Taq DNA聚合酶，10 x缓冲液，脱氧核昔酸购自 TaKaRa公司；DNA Gel Extraction it购自Saneon公司。 设备： pC200自动热循环仪(MJ Rese。h公司生产h Power－PAC3000稳压稳流电泳仪及PROTEINX厂电泳系统闷IO－RAD公司生产人 实验方法 1．DNA提取 采用常规酚－氯仿法抽提白细胞中的基因组DNA。 2．PCR反应 反应体系25ul，循环条件：94T 8分，94t 40秒，复性40秒(复性温度见表－l人72℃40秒，循环30次，72t 7分，用2％琼脂糖凝胶检测 PCR产物。 3．SSCP及银染 PCR产物sul与等量加样缓冲液（含95％甲酚胺，20mMEDTA刀．05％漠酚蓝，0．05％二甲苯氰兰）混匀，96t变性 ·2·10分钟后，立即置人冰中，电泳采用8％的非变性聚丙烯酚胺凝胶（交联度 49：1，凝胶大小为 20cm X 18cm X 0．75cm），lx TBE缓冲液，300V恒压电泳4－5小时，电泳系统温度保持在10－14T。硝酸银染色后在自动凝胶成像及分析系统上成像。 4．PCR产物纯化和测序 PCR产物经纯化试剂盒（DNA Gel Extraction it上海Sangon公司）纯化后测序，测序应用 ABI PRISMTM 377XL DNA Sequen－cer，由大连TaKaRa公司完成。 实验结果 1．PCR－SSCP分析的结果 正常对照均为相同带型。所有患者及父母中仅有1例散发的重型患者(编号M－二－门的外显子14的PCR产物存在单链泳动变位，其表型正常的母亲 SSCP带型与正常对照相同。 2．DNA序列分折结果 单链泳动异常的 PCR产物测序结果与 Genbank中 COMP基因正常序列比较，发现该患儿COMP基因的第14内含子的5’端第22位碱基发生纯合性G——A转换(图－幻。外显子14的碱基序列与Genhank中的序列完全相同。 卞 论 软骨寡聚物基质蛋白是一种钙结合蛋白，主要表达于软骨细胞周围基质中。它是一种同源五聚体糖蛋白，分子量524KD，分子构成包括氨基端区域，类表皮生长因子重复区，类钙调蛋白（Calm－odulinJike）重复区和球状骏基端区。类钙调蛋白区是高度保守的钙离子结合区，通过电荷间相互作用与钙结合。COMP基因的第 4－19外显子编码类 EGF重复，类钙调蛋白重复以及竣基端区，内含子功能尚不明了。COMP基因突变还可导致另一种骨软 ·3·骨发育不良性疾病：假性软骨发育不全(PSACH入它与MED是等位基因病。目前 PSACH中已发现了 31种点突变和 7种小的插人或缺失性损伤，突变位点大多数也集中在编码类钙调蛋白重复基因区。 我们对COMP基因的1个突变热点外显子及另外两个进行PCR－SSCP分析，只在外显子14筛查出1例单链泳动异常，而第10和第13外显子均未发现异常，与国外报道不是很一致。其原因一方面可能是种族差异所致，另一方面可能是由于例数少，不