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目的观察由人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UCMSCs)体外诱导的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)经玻璃体腔途径移植到糖尿病大鼠眼内后,视网膜内脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达的变化和胸腺肽-1(thymosin-1,Thy-1)阳性表达的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的变化情况,探讨璃体腔移植h UCMSCs诱导的NSCs在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)的可能神经保护作用,为DR的临床防治提供基础理论依据。方法采用神经分化培养基体外诱导h UCMSCs向NSCs定向转化,倒置显微镜下观察细胞形态变化。免疫荧光染色检测NSCs标志物巢蛋白和神经源性分化因子1(neurogenic differentiation factor1,Neuro D1)表达情况。成年雄性斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley,SD)大鼠52只,采用随机数字表法分为正常对照组(A组)和糖尿病组。链尿佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射制作糖尿病大鼠模型。造模后1个月,将糖尿病组大鼠随机分为DR对照组(B组),玻璃体腔注射h UCMSCs组(C组),玻璃体腔注射h UCMSCs诱导的NSCs组(D组)。各组均为13只大鼠。干预后2、4、6、8周,免疫组织化学染色观察视网膜BDNF及Thy-1阳性染色情况,Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析视网膜阳性染色区的平均累积光密度值(integrated optic density,IOD),并对Thy-1阳性染色的RGCs计数。SPSS20.0统计学软件进行统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.h UCMSCs在神经培养基诱导3天时,60-70%细胞开始聚集形成大小不等的细胞簇,随着培养时间的增加,逐渐形成悬浮的细胞团并增大、增多。2.免疫荧光染色示20天时诱导的h UCMSCs高表达NSCs的特异性标志巢蛋白和Neuro D1,阳性细胞表达量分别占87.3%和72.6%。3.糖尿病大鼠成模38只,成模率97.43%。本实验共有26只大鼠行玻璃体腔注射,其中2只大鼠发生玻璃体腔出血,最终各组大鼠均为12只纳入研究。4.免疫组织化学染色示:(1)BDNF:A组大鼠视网膜BDNF表达阳性,各层均有表达。B组呈弱阳性表达,随干预后时间延长,染色强度呈减弱趋势。C组、D组染色强度随干预后时间延长而增强,D组染色较同期B组、C组更深。B组BDNF表达随时间逐渐减少,C组、D组BDNF表达随时间逐渐增加,D组更为明显,组内各时间点间比较差异均有显著性(F=20.325、13.540、16.896,P=0.000)。除干预后2周时C组较B组BDNF表达无明显变化,余各时间点各组间BDNF表达差异均有统计学意义(F=37.144、27.419、83.659、89.654,P=0.000)。(2)Thy-1:A组Thy-1呈阳性表达,主要表达于神经节细胞层(ganglioncelllayer,GCL)和内丛状层(inner plexiform layer,IPL)层。B组染色强度明显减弱,且随干预后时间延长染色强度逐渐降低。C、D组随干预后时间延长其染色深度逐渐增强,D组染色更深。B组Thy-1表达随时间逐渐减少,C组、D组Thy-1表达随时间逐渐增加,D组更为明显,除B组、D组干预后6周较8周Thy-1表达无明显改变,余组内各时间点间比较差异均有显著性(F=16.087、15.239、10.950,P=0.000)。除干预后2周时C组较B组Thy-1表达无明显变化,余各时间点各组间Thy-1表达差异均有统计学意义(F=26.463、51.360、61.820、101.597,P=0.000)。(3)RGCs计数:A组大鼠视网膜Thy-1阳性RGCs数目每高倍镜视野(×400)约33个,B组RGCs数随时间逐渐减少,C组、D组随时间RGCs数逐渐增多,D组大鼠更为明显,但均低于同期A组的大鼠RGCs数目,组内不同时间点差异均有统计学意义(F=7.273、17.606、16.290,P=0.000)。除干预后2周C组较B组RGCs无明显差异,B组、C组、D组余各时间点各组间差异均有统计学意义(F=100.333、117.404、70.212、90.012,P=0.000)。5.BDNF蛋白表达量与RGCs数量相关性分析结果显示BDNF的平均IOD值与RGCs数量呈正相关关系(r=0.964,P=0.000)。结论1.体外h UCMSCs能够定向诱导为NSCs,并高表达NSCs标志物巢蛋白和Neuro D1。2.STZ诱导的糖尿病大鼠6周时已经存在RGCs的丢失。h UCMSCs诱导的NSCs经玻璃体腔移植后能够减少RGCs的丢失。3.h UCMSCs诱导的NSCs经玻璃体腔途径移植到STZ诱导的糖尿病大鼠眼内,能够促进视网膜BDNF的表达。4.h UCMSCs诱导的NSCs对糖尿病大鼠视网膜的RGCs的保护作用可能与其促进BDNF的表达有关。