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背景与目的: 癌组织中常常可以观察到慢性炎症的存在,而慢性炎症又常常是造成氧化刺激及氧化损伤的关键。细胞内ROS(氧自由基)产生的主要位置在线粒体内,而慢性炎症却是细胞外ROS的主要来源。线粒体受到自身及外在炎性因子刺激必然会产生适应性变化,这种变化首先应发生在其结构及形态上。研究表明,线粒体的形态结构、数量变化及线粒体DNA(mtDNA)在癌组织中均发生了不同程度的改变,而Dynamin-related protein1(Drp1)蛋白作为促进线粒体分裂的关键蛋白,参与线粒体分裂及促进细胞凋亡的过程,与肿瘤预后有密切关系。抗线粒体抗体(Anti-Mitochondria antibody;MTC02)作为线粒体膜蛋白均匀分布于线粒体外膜上,可对线粒体的数量进行客观的评判。 本实验以免疫组化的方法检测Drp1、MTC02在食管正常上皮、非典型增生上皮及癌组织中的表达情况,用Q-PCR方法检测从单纯增生的食管上皮到癌组织各阶段的线粒体拷贝数,并且分析其与患者的临床病理参数及预后联系,初步探讨线粒体形态在食管早期癌变过程中的变化及其与临床预后的联系。 材料与方法: 1、标本:收集汕头大学医学院病理科2009-2014年间食管癌标本195例,非癌标本91例(正常粘膜71例,非典型增生20例);收集有完整随访资料的食管癌患者临床资料共95例。NE2及EC1细胞系。 2、HE染色:常规染色,镜下观察细胞形态结构,进行组织学诊断。 3、显微切割:将不同级别的组织分别显微切割,收集并提取总DNA。 4、Q-PCR:扩增目的基因检测线粒体拷贝数 5、免疫荧光:观察线粒体的相对长度 6、免疫组化:观察组织中Drp1及线粒体的表达情况. 7、数据统计:使用FSCapture及Nano Measurer1.2软件对线粒体进行相对长度测量。SPSS19.0软件进行相关的统计分析,计量资料均数差别比较采用t检验,R×C表的资料采用x2检验(理论数<5时,则用Fisher精确检验法),预后组间生存率差别使用Log-rank(Mantel-Cox) Test,显著性标准定为:p≤0.05时为差异有显著性,P≤0.0001时为差异有高度显著性。 结果: 1、拷贝数结果 以拷贝数中位数作为分级,比较癌组织,非典型增生组织,单纯增生组织,p<0.05,差异有统计学意义。且拷贝数从单纯增生到癌组织呈现逐渐递增的趋势。 2、MTC02的IHC表达结果 食管癌组织中,线粒体数量随着食管癌进展的加深而逐步递增。正常组织与非典型增生组织相比,非典型增生的食管组织中MTC02表达远高于正常组织,p<0.0001,差异有统计学意义,且正常组织与癌组织比较,MTC02在癌组织中表达明显高于正常组织,p<0.0001,差异有统计学意义,非典型增生组织与癌组织比较MTC02的表达无差异,p>0.05,差异无统计学意义。在与病人临床资料比较上发现,MTC02表达与年龄、性别、淋巴结转移、肿瘤大小、大体形态、肿瘤分级均无关,p>0.05。 3、线粒体相对长度统计 未处理EC1与未处理NE2细胞比较,MT相对长度前者明显低于后者,差异有显著统计学意义,p<0.0001。未处理的NE2与经过双氧水处理后NE2相比较,前者MT相对长度高于后者,差异均有统计学意义,p<0.0001。未处理EC1与经过双氧水处理后的NE2细胞比较,只有与处理后4h的NE2的MT值有统计学意义,p<0.0001。 4、Drp1的IHC表达结果 Drp1在NE2未处理细胞胞浆中表达较弱,而在H2O2处理后则表达明显增强,EC1未处理细胞胞浆中表达明显增强。与线粒体形态改变对应。在正常上皮组织与癌组织的比较中,Drp1在癌组织中的表达明显高于正常上皮组织,p<0.0001,差异有显著统计学意义。在与病人临床资料比较上发现,Drp1表达与年龄、性别、肿瘤位置、胸腔转移、肿瘤分级均无关,p>0.05。但在腹腔转移比较中,转移组Drp1表达高于非转移组,p<0.05,差异有统计学意义。并且发现淋巴结未转移组Drp1表达显著低于转移组,p<0.05,差异有统计学意义。与临床预后联系可以发现高表达Drp1与不良预后明显相关,p<0.0001,差异有显著统计学意义。阴性表达的生存中值为45个月,而阳性表达的生存中值为13.5个月,两者相差明显。 结论: 1、线粒体形态、数量、拷贝数在食管癌变过程中发生了明显改变,且随着癌变的进展而增多,提示癌变过程中氧化损伤加重使得线粒体发生了一系列适应性变化以适应癌组织代谢所需。 2、Drp1是影响食管癌预后的重要因素,可能成为鉴别食管癌预后的良好指标。