球虫病是世界上危害严重的寄生虫病之一,对养鸡业造成了巨大的经济损失。随着药物的广泛使用及不合理使用,耐药性成为无法避免的问题,但球虫耐药性形成的机制至今不清楚,也没有找到控制球虫产生耐药性的靶基因。本研究通过实验室诱导获得了柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药虫株,观察了盐霉素耐药株和敏感株子孢子和裂殖子的超微结构,分析了盐霉素耐药株和敏感株的差异表达基因,检测了3个鸡球虫田间分离株的耐药状况,利用单卵囊分离技术获得22个柔嫩艾美耳球虫盐霉素田间耐药株,对柠檬酸合酶(EtCS)、甲硫氨酸氨基肽酶(EtMetAP)、锚蛋白重复序列(EtANK)3个球虫耐药相关基因的特性进行了初步分析。1.柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的实验室诱导与电镜观察采用药物浓度递增法,以15 mg/kg(药物/饲料)为起始诱导浓度,经过24次传代,用鸡体药敏试验检测,获得对盐霉素60 mg/kg完全耐药的柔嫩艾美耳球虫耐药株。利用透射电镜观察了盐霉素耐药株子孢子和裂殖子的超微结构,发现耐药株虫体的形态变得不规则、细胞膜粗糙与肿胀、细胞核形状变得不规则甚至溶解、微线减少、支链淀粉增多等。2.柔嫩艾美耳球虫敏感株和耐药株的比较转录组学分析利用RNA-seq对柔嫩艾美耳球虫敏感株和盐霉素耐药株的子孢子和裂殖子进行转录组测序分析。结果显示,与敏感株相比,耐药株子孢子获得17个上调表达基因、13个下调表达基因;耐药株裂殖子获得606个上调表达基因、496个下调表达基因,子孢子和裂殖子共有差异表达基因18个。GO分析发现,耐药株子孢子的差异表达基因主要参与离子结合过程,耐药株裂殖子的差异表达基因主要参与细胞蛋白质代谢过程。用qPCR对差异表达基因进行了验证,结果与转录组测序结果基本一致。3.鸡球虫田间分离株的耐药程度检测与柔嫩艾美耳球虫盐霉素田间耐药株的分离从安徽不同养殖场收集样品,获得3个鸡球虫田间株(AH1、AH2、AH3),通过鸡体药敏试验检测了田间株对5种抗球虫药物(地克珠利、盐霉素、癸氧喹酯、甲基盐霉素、氯苯胍)的耐药程度,除AH2对氯苯胍中度耐药外,所测虫株对其他药物完全耐药。用琼脂糖技术分离获得22个柔嫩艾美耳球虫单卵囊分离株,用qPCR分析了4个差异表达基因在2个单卵囊分离株及安徽1混合种的mRNA转录水平,与转录组测序结果一致。4.三个耐药相关基因特性的初步分析对3个球虫耐药相关基因(EtCS、EtMetAP、EtANK)进行克隆、表达与纯化,制备相应抗体,分析3个基因在柔嫩艾美耳球虫球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、裂殖子的转录水平和翻译水平,结果表明这三个基因在四个阶段的转录水平和翻译水平不一致,可能是翻译后修饰的结果。间接免疫荧光表明,EtCS、EtMetAP、EtANK分别定位于子孢子除折光体外的细胞质中、子孢子表面、子孢子的顶端、都定位于裂殖子的细胞膜和细胞质中。体外抑制实验表明,这3个蛋白都参与了子孢子入侵DF-1细胞的过程。用EtCS处理鸡巨噬细胞后发现,EtCS可与巨噬细胞结合,抑制巨噬细胞的增殖及NO的产生。对敏感株和不同耐药株进行转录水平分析,发现这3个基因在柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株中表达都显著上调,而在盐霉素耐药株中差异不显著,与转录组结果一致。但这3个基因在耐药株中的蛋白翻译水平与转录结果不一致。利用qPCR分析3个基因在单卵囊分离的盐霉素田间耐药株、安徽1混合种、单卵囊分离的地克珠利田间耐药株的mRNA转录水平,结果显示,与敏感株相比,3个基因在安徽1混合种的转录水平都很低;在3株地克珠利田间耐药株中,除EtCS在其中2株下调表达外,其余都上调表达;在3株盐霉素田间耐药株中,EtMetAP表达上调和EtCS表达下调,EtANK差异不明显;与盐霉素转录组结果不一致,可能是由于分离的田间耐药株存在多重耐药性。结论:本研究利用诱导获得的柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株和敏感株进行比较转录组学分析获得差异表达基因,用田间分离的柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株进行了验证,选取3个耐药相关基因进行初步分析,结果为进一步研究球虫耐药性产生的分子基础提供了基础。