深海是特殊的生态环境,常年处于黑暗、低温、高盐及高压的状态。深海沉积物中存在着大量的微生物,他们能分泌多种胞外蛋白酶将环境中的有机氮降解为氨基酸和寡肽,吸收后供自身生长繁殖,也对海洋氮循环具有重要作用。但深海微生物是如何感知到环境中有机氮的存在进而启动胞外蛋白酶的表达和分泌,如何将分解产生的氨基酸和寡肽转运到体内,目前研究并不清楚。Pseudoalteromonas sp.SM9913是本实验室从深海沉积物中分离得到的一株高产蛋白酶细菌。在以酪蛋白为唯一氮源的培养基中,它能够分泌多种胞外蛋白酶,其中以丝氨酸蛋白酶MCP-01为主。前期研究表明SM9913的二/三肽转运蛋白Dtp可能与MCP-01的诱导表达有关。本研究通过生理生化、转录组学及分子遗传学等手段初步揭示了 Dtp在肽转运和胞外蛋白酶诱导中的作用。1.Ps.sp.SM9913肽转运系统的缺失突变株△dtp回补菌株和点/截短突变菌株的构建为了更好的研究二/三肽转运蛋白Dtp在肽转运和胞外蛋白酶诱导表达中的作用,在前期构建的dtp缺失突变株△dtp的基础上,利用基因回补技术构建了dtp基因回补菌株dtp-pEV-△dtp,和空载对照株pEV-△dtp,并通过Western Blot在野生株SM9913和回补菌株dtp-pEV-△dtp的细胞膜上均检测到了 Dtp的表达,而缺失突变株△dtp和空载对照株pEV-△dtp均未检测到,进一步证实了 Dtp在SM9913细胞膜上是能够表达的。为了研究Dtp转运肽的分子机制,我们根据已发表的Dtp同源蛋白的晶体结构,预测了 Dtp中结合质子和结合底物的6个关键氨基酸残基,并对这些关键氨基酸残基进行定点突变,然后将点突变的dtp基因回补到△dtp中得到7个点突变株。为了研究Dtp感应和传递信号的结构基础及分子机制,通过结构分析,我们预测了 Dtp中可能向胞内传递信号的区域,并对这些关键区域进行缺失突变,并将缺失突变的dtp基因回补到△dtp中得到2个截短突变株。以上回补株及突变株的构建为以后进一步研究Dtp在肽转运和胞外蛋白酶诱导表达中的类转运受体功能及其机制奠定了基础。2.Ps.sp.SM9913二/三肽转运蛋白Dtp的肽转运功能研究为了研究二/三肽转运蛋白Dtp是否有转运二肽或三肽的能力,我们在以二肽或三肽为唯一氮源的培养基中培养野生株、肽转运系统缺失突变株及回补株并分析其生长状况,结果表明,SM9913能够在二肽及三肽培养基中生长,二/三肽转运蛋白Dtp缺失突变株△dtp的生长受到明显的抑制,二肽转运蛋白DppA缺失突变株△dppA的生长基本不受影响,而dtp回补株dtp-pEV-△dtp的生长得到回复,说明Dtp具有转运二肽和三肽的能力。为了更直观的检测Dtp对三肽的转运,我们研究了 SM9913对不同种类三肽的转运能力,并选用了其中转运活性最高的两种三肽进行FITC荧光标记,然后用FITC标记的三肽孵育SM9913菌株,通过荧光显微镜可以在胞内观察到荧光,证明三肽可以被Dtp转运到胞内进行利用。为了研究Dtp转运肽的分子机制,我们以三肽为唯一氮源培养所构建的7个点突变株,结果显示E300A-pEV-△dtp的生长受到最明显的抑制,且通过分析Dtp同源蛋白的晶体结构,预测到Glu300可能是与底物结合有关的关键氨基酸,因而推测Dtp对三肽的转运能力可能与其结合底物的能力是密切相关的。以上研究结果证实深海细菌SM9913的二/三肽转运蛋白Dtp具有转运二肽和三肽的能力,并推测了 Dtp中Glu300是一个与底物结合转运有关的关键氨基酸残基,且能够影响Dtp转运肽的功能。3.比较转录组分析Ps.sp.SM9913的二/三肽转运蛋白Dtp在胞外蛋白酶诱导表达中的作用为了研究SM9913中Dtp与胞外蛋白酶诱导表达的关系,我们对在酪蛋白培养基中培养的SM9913和△dtp进行了转录组测序和生物信息学分析。结果显示,在酪蛋白诱导条件下,SM9913.中包括MCP-01在内的20个胞外蛋白酶基因是上调表达的,其中MCP-01的表达量最高,且Dtp也是上调表达的;而在△dtp中包括MCP-01在内的12个胞外蛋白酶基因的表达量较SM9913发生了明显的下降,其中MCP-01的表达量要远远低于SM9913。以上结果与荧光定量PCR的结果一致,均证明Dtp的缺失会影响酪蛋白对胞外蛋白酶的诱导表达,Dtp在SM9913胞外蛋白酶诱导表达中可能具有感应胞外信号的感应受体功能。综上所述,我们的研究结果初步揭示了二/三肽转运蛋白Dtp在SM9913中可能作为类转运蛋白受体的类型及功能,并推测了 Dtp可能的作用机制:在酪蛋白为唯一氮源的培养基中,SM9913本底表达的胞外蛋白酶将环境中的酪蛋白降解为寡肽,为了生存需要启动了 Dtp的上调表达,从而将胞外降解的寡肽产物转运到胞内提供能量;另外,Dtp也能感知到这些寡肽,并将胞外营养物质存在的信号传递到胞内,然后在胞内经过一系列的信号传递和多种转录调控因子的作用,启动了一系列胞外蛋白酶的表达及分泌,进一步对胞外的营养物质进行降解利用,同时也启动了包括Dtp在内的一系列相关转运蛋白的上调表达,促进对底物的吸收利用。因此,Dtp在SM9913中可能是一个保留有转运功能的类转运蛋白受体。