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子宫是奶牛生殖系统的重要组成部分,是胚胎附植发育的主要场所,子宫生理结构与功能的完整性关系到奶牛养殖业的发展。奶牛产后由于子宫颈开放,大量细菌进入子宫腔内引发奶牛子宫内膜炎,其中大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是主要致病菌之一,主要通过脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)发挥致病作用。甲硫脑啡肽(Met-enkephalin,MENK)是一种具有阿片样作用的多肽,MENK已被证实参与调控细胞增殖。MENK及其受体存在于子宫内膜中,但其对奶牛子宫内膜基质细胞(Bovine Endometrial Stromal Cells,BESC)增殖的影响尚无研究。因此,本试验以BESC为研究对象,探究在LPS作用下MENK对BESC增殖的影响机制,为防治奶牛产后子宫感染提供新思路。采用LPS(10 μg/mL)诱导原代BESC的炎性反应,在分子水平上探究MENK对BESC增殖的影响机制。利用CCK-8检测细胞活性,细胞划痕试验观察细胞迁移率,流式细胞术检测细胞周期,荧光定量PCR检测细胞增殖相关基因VEGFA、CCN2、TGFB1和TGFB3的mRNA表达变化,蛋白质印迹法检测Wnt/β-catenin和PI3K/AKT相关通路蛋白的表达,免疫荧光观察β-catenin入核情况。结果表明:采用10-12、10-10和10-8mol/L MENK分别处理细胞24h,对基质细胞活性无显著影响(P>0.05);采用LPS单独处理或LPS与MENK(10-12、10-10、10-8mol/L)共处理细胞24h,对基质细胞活性无显著影响(P>0.05)。检测0、12和24 h的细胞迁移速度发现,LPS可以降低(P<0.05)细胞迁移率,加入MENK后对细胞迁移率无显著影响(P>0.05)。采用LPS单独处理细胞24h,G1期细胞增多(P<0.01),S和G2期细胞减少(P<0.01);LPS 与 MENK(10-12、10-10、10-8mol/L)共处理 24 h,G1 期细胞减少(P<0.05),S和G2期细胞增多(P<0.05)。采用10-8、10-10和10-12mol/L MENK分别处理细胞,与空白对照组相比,VEGFA、CCN2、TGFB1和TGFB3的表达出现显著上调(P<0.05)、下调(P<0.05)或不变(P>0.05);与空白对照组相比,LPS组各基因表达下调(P<0.05)或不变(P>0.05);与 LPS 组相比,LPS 与 MENK(10-12、10-10、10-8mol/L)共处理组VEGFA、CCN2和TGFB1基因表达上调(P<0.05)或不变(P>0.05),TGFB3基因表达下调(P<0.05)或不变(P>0.05)。采用10-8、10-10、10-12mol/L MENK处理细胞,对Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信号通路蛋白水平无显著影响(P>0.05)。与空白对照组相比,LPS组细胞的β-catenin、c-Myc、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)和糖原合成激酶(Glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)蛋白表达上调(P<0.05),PI3K 和AKT磷酸化水平下调(P<0.01);与LPS组相比,LPS与MENK(10-12、10-10、10-8 mol/L)共处理组β-catenin和GSK-3β蛋白表达下调(P<0.05),AKT磷酸化水平降低(P<0.05),PI3K磷酸化水平无显著变化(P>0.05)。MENK阻止了 LPS诱导的β-catenin入核。以上结果说明,MENK可以促进LPS作用下BESC的增殖,可能是通过调控细胞周期、增殖相关因子及Wnt/β-catenin和PI3K/AKT相关通路发挥作用。为明确MENK调控BESC增殖的作用机制,采用LPS、阿片受体拮抗剂和MENK共处理细胞。本试验使用的阿片受体拮抗剂包括非选择性阿片受体拮抗剂纳洛酮(Naloxone,Nx)、δ阿片受体拮抗剂ICI154129和μ阿片受体拮抗剂CTAP,分组为:空白对照组,LPS处理组,LPS与MENK(10-10mol/L)共处理组,LPS、MENK和阿片受体拮抗剂(Nx、CTAP和ICI154129,均为10-10 mol/L)共处理组以及LPS与阿片受体拮抗剂共处理组。检测细胞活性、细胞周期、细胞增殖相关因子mRNA变化以及Wnt/β-catenin和PI3K/AKT相关通路蛋白的表达。结果表明:阿片受体拮抗剂单独或与LPS共处理细胞24h,对细胞活力无显著影响(P>0.05)。与LPS和MENK共处理组相比,LPS、MENK和Nx共处理组以及LPS、MENK和ICI154129共处理组的G1期相对细胞数升高(P<0.05),LPS、MENK和Nx共处理组以及LPS、MENK和CTAP共处理组S期相对细胞数降低(P<0.05)。与LPS和MENK共处理组相比,LPS、MENK和Nx共处理组以及LPS、MENK和ICI 154129共处理组细胞CCN2、TGFB1和TGFB3基因表达下调(P<0.01),LPS、MENK和CTAP共处理组细胞CCN2基因表达下调(P<0.01)或不变(P>0.05)。与LPS和MENK共处理组相比,LPS、MENK和Nx共处理组cyclinD1和GSK-3β蛋白表达上调(P<0.05),LPS、MENK和ICI 154129共处理组细胞β-catenin和GSK-3β蛋白表达上调(P<0.01),LPS、MENK和CTAP共处理组细胞cyclinD1蛋白表达上调(P<0.05);与LPS和MENK共处理组相比,LPS、MENK 和 Nx 共处理组、LPS、MENK 和 ICI154129 共处理组和 LPS、MENK和CTAP共处理组AKT磷酸化水平升高(P<0.05)。以上结果说明,μ阿片受体和δ阿片受体均参与MENK对BESC的促增殖作用。综上所述,MENK通过调控细胞周期、细胞增殖相关因子及Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信号通路发挥作用,促进了 BESC在LPS作用下的细胞增殖。MENK对细胞的增殖作用是通过δ阿片受体和μ阿片受体介导的。