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前言 肿瘤的发生机制十分复杂，不仅涉及多种癌基因、抑癌基因的变化，而且一些细胞因子在肿瘤的发生发展中也起到一定的作用。尽管这些基因、细胞因子对细胞的作用方式不同，作用途径和作用部位有别，但最终结果都将导致细胞的恶性增殖。因此，肿瘤的生长不仅是病变体积的增长，更重要的是细胞增殖活性发生变化，研究增殖活性是了解肿瘤生物学行为的一个重要手段。肿瘤细胞增殖活性的增加可能导致多克隆亚群的产生并有助于其中的某些亚群获得浸润、转移能力。 增殖细胞核抗原（PCNA）是一种分子量为36kD的酸性核蛋白，为DNA多聚酶δ的辅酶。PCNA可作为细胞周期的内源性组织标记物，其表达程度与细胞增殖周期关系密切，因此作为评价细胞增殖活性的指标之一。在许多恶性肿瘤如结肠癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌中，PCNA阳性表达率表示肿瘤细胞的增殖活性，与肿瘤转移潜能、复发均有显著相关性。 肿瘤的生长是一个多阶段、多步骤并涉及到多因素的过程。在此过程中，微血管的形成同肿瘤生长和转移密切相关。现已证实，肿瘤细胞能分泌某些促血管形成物质称之为肿瘤血管形成因子（TAF），TAF对肿瘤血管的生成十分重要。血管内皮细胞生长因子（VEGF）在肿瘤血管形成中发挥着重要作用，血管内皮生长因子及其受体是血管生成过程中的关键因子，与肿瘤生长侵袭及转移关系密切。实体瘤增生和转移离不开血管生成，血管生成是恶性肿瘤迅速增殖、转移扩散的主要条件之一，其中VEGF发挥着重要作用。 基质金属蛋白酶（MMP）是一类以Zn2+为辅助因子的蛋白酶家族，在体内主要降解细胞外基质（ECM），参与结缔组织的降解和重建、炎症反应、肿瘤扩散转移和缺血缺氧损伤等。体内多种细胞均能产生MMP，如各种肿瘤细胞、成纤维细胞、血液中的单核细胞和巨噬细胞等。血管内皮细胞也能产生MMP，内皮细胞产生的MMP在血管发生、形成和再生中具有重要意义。 基质金属蛋白酶9（MMP-9）是MMPs家族中的重要一员，它的底物为基底膜和细胞外基质的主要成份—W型胶原酶，起骨架的作用，是降解基底膜和细胞外基质成分的蛋白水解酶，可促进癌细胞对周围组织的浸润，在肿瘤的浸润、转移及血管的生成中发挥重要的作用。具有转移倾向的癌细胞可以自身分泌或诱导其他细胞分泌大量的MMP一，破坏基底膜的完整性，导致癌细胞向其他部位转移。血管发生极大的依赖于基质金属蛋白酶的活性，肿瘤新生血管的生长也可为基质金属蛋白酶抑制剂所抑制。MMP-9能上调肿瘤血管化的损害程度，是血管发生启动系统中重要的一员。 本文检测了人胃癌手术切除标本VEGF和MMP一与PCNA的表达，研究VEGF、MMP一和PCNA的关系，探讨三者在胃癌中促肿瘤生长的作用机制及相互关系，探讨三者与胃癌生物学行为的关系。材料与方法 1.临床资料 全部50例胃癌标本均为我院2002年9月一2003年6月间手术切除的胃癌标本，均经病理学检查证实为胃腺癌。其中男32例，女18例。中位年龄54岁。所有病人术前均未接受任何治疗。 2.标本采集 手术后的肿瘤组织，避开缺血坏死组织，切取0.scmXO.scn议1.ocm大小，将一块标本装在一个小管中，10%的福尔马林保存液保存，并且使保存液的体积为标本体积的4一5倍。标记小管，并在记录本上做标本登记。将登记好的标本存于4℃冰箱中，一个月左右，集中数例标本用石蜡包埋一次，石蜡切片厚度5微米，石蜡块长期保存。 3.主要试剂和仪器 鼠抗人血管内皮生长因子单克隆抗体，鼠抗人基质金属蛋白酶9单克隆抗体，鼠抗人增殖细胞核抗原单克隆抗体，均购于福州迈新生物技术有限公司。即用型免疫组化S一P试剂盒、EDTA抗原修复缓冲液购于福州迈新生物技术有限公司。 4.方法 石蜡切片常规脱蜡、水化。 PBS洗3分钟x3次。 抗原修复:EDTA抗原热修复法（水浴法）:取一定量的1 MMEDTA抗原修复液于烧杯中，放人盛水的电饭锅中，盖上锅盖进行热煮，至锅中水沸腾，再将组织切片放在耐高温染色架上，放进烧杯中，注意组织片一定要完全浸泡在EDTA溶液中，继续煮20分钟。煮好后，从锅中取出烧杯，室温下放置20分钟，待冷却后从烧杯中取出切片。 蒸馏水洗3分钟xl次，PBS洗3分钟xZ次。 每张切片加1滴过氧化酶阻断溶液（试剂A），以消除内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10分钟。 PBS洗3分钟x3次。 每张切片加1滴非免疫动物血清（试剂B）封闭消除非特异性染色，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗。 滴加一抗（鼠抗人血管内皮生长因子单克隆抗体/鼠抗人基质金属蛋白酶9单克隆抗体/小鼠抗人增殖细胞核抗原单克隆抗体），4℃过夜。 PBS洗，5分钟x3次。 甩去PBS液，滴加生物素标记的二抗（试剂C），室温孵育10分钟。 PBS洗，3分钟x3次。 甩去PBS液，滴加链霉菌抗生物素一过氧化物酶溶液（试剂D），室温孵育10分钟。‘ PBS洗，3分钟x3次。 甩去PBS液，显色剂显色（DAB）。 自来水充分冲洗。 苏木素复染。0.1%HCL分化，PBS洗返蓝。 ?