目的:目前,肺癌已成为发病率及死亡率最高的恶性肿瘤,其中约85%-90%为非小细胞肺癌（NSCLC）。在NSCLC中,有约1/3甚至更多比例的患者伴有EGFR19位点外显子突变（19del,54%）或21位点的点突变（L858R,43%）。而合并这两种突变的患者可从酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的治疗中获益。因此,TKIs类药物已成为治疗EGFR体细胞突变肺癌的主要靶向药物。其中用于治疗的一线药物主要为Gefitinib（IRESSA）,Erlotinib（TARCEVA）。与化疗相比,这几种靶向药物具有更好的客观反应率（ORR）和无进展生存期（PFS）。然而,在用这两种药物治疗后,会有50%甚至更高的患者出现耐药的现象。虽然已有研究表明约半数以上的耐药是由于T790M的突变所致,但仍有30%的耐药机制至今尚不明确。因此,对于TKIs类耐药机制的深入探索,不仅对肺癌患者的预后评估、治疗策略的制定大有益处,而且也能为防止耐药和开发出新的有效的靶向治疗药物提供实验基础,具有重要的理论和现实意义。表皮生长因子受体（EGFR）家族在肿瘤发生发展中所起的作用是十分重要的。EGFR的高表达可以促进肿瘤的发生、发展和预后不良。近10年来陆续有文章揭示了EGF可以刺激细胞膜EGFR（mEGFR）转位入细胞浆,再通过其入核序列与impotinβ蛋白结合通过核孔,进入细胞核内。这一观点说明EGFR可以存在于细胞膜、细胞浆与细胞核的定位变化。也有文章提出EGFR可能会做为浆/核穿梭的转录因子并在影响肿瘤进展中起到重要作用。近10年来,陆续有研究证实了EGFR入核后（nEGFR）的重要作用机制。nEGFR可促使7种癌基因（CyclinD1、iNOS、B-Myb、Aura Kinase A、COX-2、C-Myc、BCRP）的激活,进而促进肿瘤的发生发展及耐药的出现;同时,nEGFR还可以调节mRNA的稳定并促进蛋白质的翻译并最终引起放疗的抵抗。然而,突变型的EGFR蛋白能否入核,其入核的机制是否与野生型的相同,入核以后所发挥的作用是什么,则还不清楚。近年来,关于Hippo通路活性抑制所引起TKIs耐药的报道越来越多。Hippo通路最初是在果蝇中被发现和研究的,其主要组成蛋白包括:上游分子（Fat,NF2,WWC1,AMOT蛋白等）、中央激酶复合体（MST1/2-WW45-LATS1/2-MOB）和下游效应分子（YAP蛋白）等,Hippo通路的核内靶基因包括了CTGF,CyclinE和DIAP等。当Hippo通路激活时,中央激酶复合体内的MST1/2会使WW45磷酸化,p-WW45会磷酸化LATS1与MOB1,进而使YAP磷酸化（p-YAP）,从而使其与14-3-3蛋白结合,并被最终降解;当Hippo通路活性被抑制时,YAP则不会被中央激酶复合体磷酸化,从而由胞浆转入细胞核内,进而与共辅助激活因子TEAD协同激活其核内靶基因（CTGF、CyclinE等）的表达,最终促进肿瘤的增殖、侵袭和耐药现象的产生。但是,截至目前为止,只知道TKIs的耐药与Hippo通路活性抑制有关,其如何被抑制的具体机制尚不完全清楚。在本篇文章中我们注意到,耐药细胞中会出现膜EGFR（mEGFR）转位入细胞浆的现象,细胞浆中的EGFR（cEGFR）会滞留在胞浆中,直至YAP入核才会转位入核（nEGFR）。这种现象引起了我们极大的兴趣,因此,我们做出两点猜测:首先,cEGFR是否是通过某种机制抑制了Hippo通路活性,最终导致YAP入核的。其次,cEGFR的入核是否与YAP入核存在着某种联系。研究方法::我们收集了21例辽宁省肿瘤医院肺腺癌晚期未经TKIs治疗同时合并TIKs体细胞突变的患者的穿刺标本。首先应用免疫组织化学染色的方法对EGFR在穿刺标本定位和表达情况进行检测,利用统计学分析（卡方检验）对EGFR在肺腺癌细胞中的不同定位与患者无进展生存期（PFS）的关系进行分析。之后,我们在HCC827细胞系中用Gefitinib与Erlotinib进行耐药诱导,诱导耐药的过程中,我们通过激光共聚焦监测EGFR在细胞中定位的变化。诱导成功的两种耐药细胞系分别命名为HCC827/GR与HCC827/ER,并采用MTT,集落形成,Transwell,细胞凋亡等实验检测耐药细胞的增殖,侵袭,抗凋亡能力及IC50的变化。接下来我们通过Western Blot对比耐药前Hippo通路主要蛋白及p-EGFR表达水平的变化。用免疫激光共聚焦及荧光素酶报告基金监测YAP入核及Hippo通路活性的变化。后采用SPSS22.0统计分析软件对实验数据进行分析,P<0.05说明结果具有统计学意义。1.结果:1.我们发现突变的EGFR在21例肺腺癌晚期未经TKIs治疗的患者中,存在细胞与细胞浆两种不同的定位,并且这种定位的不同会影响患者的无进展生存期（PFS）。通过卡方检验证实EGFR定位于细胞膜患者的PFS要明显长于EGFR仅定位于细胞浆的患者（411±107.6 days vs 202.5±96 days）。在体外实验中,我们首先选择同为EGFR 19 del突变,但EGFR定位不同的两种细胞系PC-9（EGFR定位于细胞浆）与HCC827细胞系（EGFR定位于细胞膜）,通过MTT检测两种细胞系对于Gefitinib与Erlotinib的IC50的不同,发现PC-9的IC50要明显高于HCC827细胞系（P<0.001）。我们选择HCC827细胞系进行Gefitinib与Erlotinib的耐药诱导,发现在诱导耐药的过程中,EGFR逐渐从细胞膜转移入细胞浆最后入细胞核。2.通过对比细胞耐药前后Hippo通路主要蛋白,p-EGFR及其下游主要蛋白表达水平的变化发现,Hippo通路中p-MST1,p-LATS1,p-YAP表达水平下调,YAP及其核内癌基因CTGF,CCNE表达水平上调;同时p-EGFR及其下游主要蛋白仍然处于低表达状态。3.在诱导耐药过程中,我们发现EGFR首先从细胞膜转位入细胞浆,然后才出现Hippo通路活性的抑制。通过质谱分析与免疫共沉淀发现,细胞浆中的EGFR是可以与SIK2相互结合的。免疫共沉淀（定量）证实,耐药后SIK2与SAV1结合增多,同时LATS1与MST1结合减少;在耐药细胞中干扰EGFR后,SIK2与SAV1结合减少,LATS1与MST1结合增多。4.在诱导耐药过程中,我们发现EGFR与YAP入核时项相同,通过免疫荧光与免疫共沉淀证实,在耐药细胞中EGFR与YAP存在着核浆共定位,且两者可以相互结合。在干扰YAP后EGFR入核减少,转染YAP后,EGFR入核增多。5.在体内实验中,我们证明了耐药细胞在稳定敲除YAP或SIK2后,其对TKI是的敏感性会得到一定程度的恢复。结论:1.吉非替尼治疗发现EGFR膜阳性患者的PFS明显长于细胞浆表达者;2.应用TKIs诱导肺癌细胞发生耐药伴随EGFR蛋白的膜/浆转位;3.转位入浆的EGFR抑制Hippo通路活性并引起TKIs耐药。4.细胞浆中的EGFR通过SIK2抑制Hippo通路活性。5.EGFR与YAP结合后被其带入细胞核内;6.稳定干扰HCC827/ER细胞中的SIK2或YAP后可部分恢复对厄洛替尼的敏感性。这些结果为非小肺癌细胞肺癌患者对于TKIs的敏感性以及新的靶向药物的研发提供了实验和理论基础。