[研究背景]帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是由锥体外系功能障碍引起的一种中枢神经系统慢性退行性疾病,会严重影响人类的生活质量。PD典型病理特征为黑质致密部(Substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺能神经元的变性丢失和以α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-SYN)的异常聚集为主要成分的路易小体。PD发病机制十分复杂,衰老、遗传、感染、免疫异常、神经毒素、氧化应激等多种因素均对PD的发病起到一定的作用。近几年的临床研究发现,在PD病人的黑质纹状体部位存在活性小胶质细胞和它们引起的的慢性炎症反应。大量的动物和细胞实验也表明炎症反应参与了PD的发生发展。这些研究表明,小胶质细胞过度激活及其所介导的神经炎症反应是PD的重要致病因素之一。小胶质细胞在中枢神经系统中是一种固有的免疫细胞,在正常情况在处于静息状态,在不同的微环境因素刺激下,小胶质细胞可存在两种极化的激活方式:M1型极化(经典活化:产生促炎反应及神经毒性)和M2型极化(选择性活化:发挥抗炎及损伤修复作用)。M1型小胶质细胞在炎症早期可产生并释放多种致炎因子及氧自由基等有害物质,加重神经元的损伤继而加重PD。相反,M2型小胶质细胞在炎症晚期可产生抗炎因子、分泌一些神经营养物质,抑制炎症反应、促进组织修复。因此,通过调控节小胶质细胞的表型,促进小胶质细胞由促炎的M1表型向抗炎的M2表型转化,将为PD提供新的治疗策略。然而,小胶质细胞表型转化的调控机制目前尚不清楚。髓样细胞触发受体 Ⅱ(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)是表达于髓样细胞的一种免疫球蛋白样受体,在中枢神经系统中高表达于小胶质细胞,具有抑制小胶质细胞炎症,增加其吞噬能力的作用。2013年新英格兰医学杂志报道TREM2基因突变是阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)的危险因素,随后的进一步研究发现TREM2基因突变也可增加PD的发病风险。那么,TREM2可以调控小胶质细胞的活化状态吗?调控TREM2的表达能否改善帕金森病的神经炎症损伤?我们通过体内、体外实验发现抑制TREM2的表达加重α-SYN所致的神经炎症,导致小胶质细胞由M2型向M1型转化,首次阐明TREM2是调控小胶质细胞表型转化的重要信号分子。本研究有助于帕金森病新型治疗手段和药物的研发。[研究目的]阐明TREM2调控小胶质细胞表型在α-SYN所致PD模型中的作用。[研究方法]体外实验:1.体外培养BV2小胶质细胞,并给于LPS、6-OHDA、MPP+及α-SYN刺激,24 h 后收取细胞用 realtime RT-PCR 和 Western Blot 检测 TREM2 mRNA 和蛋白表达水平的变化。2.体外培养BV2小胶质细胞,在不同时间点,给予BV2小胶质细胞α-SYN刺激,细胞培养至一定时间后,收取细胞,通过realtime RT-PCR和Western Blot检测NOX2、COX2及iNOS的mRNA和蛋白表达水平变化。3.体外培养BV2小胶质细胞,通过转染TREM2-siRNA将TREM2敲低后加入α-SYN刺激,4 h后收取细胞,用realtimeRT-PCR和Western Blot方法检测IL-1β、TNF-α、IL-6等炎症因子及NOX2、COX2及iNOS的mRNA和蛋白表达水平的变化。4.体外培养BV2小胶质细胞,通过转染TREM2-siRNA将TREM2敲低后加入IL-4,24h后收取细胞用realtime RT-PCR方法检测ARG1的mRNA水平的变化,用Western Blot方法检测p-STAT1、p-STAT6、STAT1、STAT6和ARG1的蛋白水平变化。5.体外培养BV2小胶质细胞,通过转染TREM2-siRNA将TREM2敲低后加入α-SYN刺激,细胞培养8h后,分别加入ROS探针,并收取细胞,通过流式细胞仪检测BV2小胶质细胞内ROS水平。6.体外培养BV2小胶质细胞,通过转染TREM2-siRNA将TREM2敲低后加入α-SYN刺激,细胞培养4 h后,收取上清作为条件培养基用来培养SH-SY5Y细胞,并通过CCK-8和流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞存活率和凋亡情况。体内实验:1.通过脑立体定位注射技术,向野生C57BL/6(wildtype,WT)小鼠黑质部位立体定位注射AAV-SYN腺相关病毒构建PD动物实验模型,于造模后1 w、2w、3w、4w取黑质和纹状体,Westernblot检测TH和TREM2的蛋白表达水平,realtime RT-PCR检测TREM2 mRNA水平的变化。2.向WT小鼠纹状体部位立体定位注射6-OHDA构建PD动物实验模型,于造模后1d、1w、2 w、3 w、4 w取黑质和纹状体,Westernblot检测TH和TREM2的蛋白表达水平,realtime RT-PCR检测TREM2 mRNA水平的变化。3.通过脑立体定位注射技术,向WT小鼠和TREM2基因敲除(TREM2-/-)小鼠黑质部位立体定位注射AAV-SYN,对照组注射AAV-GFP。造模3w、8w、10 w后取脑组织做冰冻切片,利用免疫荧光实验技术分别进行TH、IBA1及GFAP染色,观察TREM2-/-小鼠与WT小鼠黑质部位TH阳性细胞数目,以及小胶质细胞(IBA1)和星形胶质细胞(GFAP)数目及形态改变。4.通过脑立体定位注射技术,向野生WT小鼠和TREM2-/-小鼠黑质部位立体定位注射AAV-SYN和AAV-GFP。造模3 w后取脑组织,免疫荧光染色观察iNOS 及 ARG1 表达情况,Westernblot 检测ARG1、iNOS、NOX2、COX2、p-STAT1、P-STAT6、STAT1 和 STAT6 的蛋白表达水平。[实验结果]1.体外给予BV2小胶质细胞LPS、MPP+、6-OHDA和α-SYN刺激后,TREM2 mRNA及蛋白水平均降低;在6-OHDA及AAV-SYN PD小鼠模型中,TREM2 mRNA及蛋白表达水平先升高后降低。2.体外给予BV2小胶质细胞α-SYN刺激不同时间点后,IL-1β、TNF-α、iNOS等炎症因子的mRNA和蛋白水平在4 h时达高峰。3.利用TREM2-siRNA敲低BV2小胶质细胞中TREM2,可加重α-SYN所介导的小胶质细胞向M1表型极化,引起炎症反应,使M1型marker如TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的mRNA水平及iNOS、NOX2和COX2等蛋白表达水平升高。4.IL-4诱导BV2小胶质细胞向M2表型极化,增加M2型markerARG1的表达,敲低TREM2后能显著抑制IL-4所致的ARG1 mRNA和蛋白水平的升高。5.在AAV-SYN所致的PD小鼠实验模型中,与WT小鼠相比,造模3 w、8 w、10 w后TREM2-/-小鼠黑质部位的小胶质细胞和星型胶质细胞过度激活。6.在AAV-SYN所致的PD小鼠实验模型中,与WT小鼠相比,造模3 w后TREM2-/-小鼠脑内M1型marker如iNOS、NOX2和COX2蛋白表达水平明显升高,M2型markerARG1表达水平明显降低。7.敲低BV2小胶质细胞的TREM2后,可加重α-SYN所致BV2小胶质细胞中ROS水平的升高。8.敲低BV2小胶质细胞的TREM2后,加入α-SYN刺激,收集条件培养基培养SH-SY5Y细胞,可明显增加SH-SY5Y细胞死亡,并导致SH-SY5Y细胞存活率降低。9.在AAV-SYN所致的PD小鼠实验模型中,与WT小鼠相比,造模3 w、8 w后TREM2-/-小鼠黑质部位TH阳性细胞数目明显减少。10.IL-4诱导BV2小胶质细胞p-STAT6的表达增加,p-STAT1的表达降低,使小胶质向M2表型极化;敲低TREM2后,给予IL-4刺激,导致p-STAT1蛋白表达水平升高及p-STAT6蛋白表达水平降低。11.在AAV-SYN所致的PD小鼠实验模型中,与WT小鼠相比,造模3 w后TREM2-/-小鼠脑内p-STAT1蛋白表达水平明显升高,p-STAT6蛋白表达水平明显降低。[结论]TREM2可通过调节小胶质细胞表型减轻PD神经炎症反应,从而对α-SYN所致帕金森病模型产生神经保护作用。