脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族成员,不仅在神经系统广泛表达,在哺乳动物的卵巢中也表达。研究表明,BDNF对哺乳动物卵泡发育、卵母细胞成熟及早期胚胎发育起重要作用。本研究旨在探讨BDNF对水牛卵母细胞体外成熟的影响,并对其相关作用机制进行初步研究,以期进一步优化卵母细胞体外成熟培养体系,提高胚胎体外生产的效率。1.水牛BDNF基因克隆、序列分析及其在不同组织中的表达模式。测序结果显示,克隆获得的水牛BDNF基因全长800bp,编码区753bp,编码250个氨基酸,其核苷酸和氨基酸序列与多个物种的同源性都很高；蛋白结构预测分析显示,BDNF定位在细胞内且为含有信号肽序列的分泌型蛋白,其三级结构由多个α-螺旋、3对反向平行的p-折叠结构等构成活性中心,即NGF功能结构域；qRT-PCR检测结果显示,BDNF在胎儿及成年水牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、’肾脏、大脑、皮肤、肌肉、卵巢、睾丸10种组织中均有表达,在卵巢上高表达；受体TrkB. p75在胎儿及成年水牛各组织中的表达模式与BDNF并不完全一致,但TrkB在卵巢中高表达,而p75在卵巢中表达很低。2. BDNF及其受体在水牛卵泡、卵母细胞及早期胚胎中的表达模式。利用免疫组化、ELISA、免疫荧光染色及qRT-PCR等方法的检测结果发现,BDNF在水牛卵泡发育各时期均有表达,且主要在卵母细胞、颗粒细胞及卵丘细胞中表达,同时在直径4<Φ≤7mm的卵泡中,卵泡液BDNF浓度、卵泡颗粒细胞BDNF mRNA及TrkB mRNA的表达水平均最高,Φ>7mm的次之,2≤Φ≤4mm的最低,且存在显著性差异(P<0.05),而p75 mRNA表达水平很低；水牛COCs在体外成熟过程中(0h、6h、12h、24 h), BDNF mRNA在卵母细胞及卵丘细胞上表达呈逐渐上升趋势,TrkB mRNA在卵丘细胞上表达呈先上升后下降趋势,但在卵母细胞上不表达,p75 mRNA在卵母细胞及卵丘细胞上表达呈先降低后快速上升趋势；水牛早期胚胎在发育过程中(2cell、4cell、8cell、桑椹胚、囊胚),BDNF mRNA表达呈先上升后下降趋势,4cell表达最高,p75 mRNA表达呈逐渐下降趋势,2cell表达最高,BDNF及p75在桑椹胚及囊胚表达都很低,而TrkB在胚胎发育过程中不表达。3. BDNF对水牛卵母细胞体外成熟的影响及其作用机制。在体外成熟液中添加lOng/ml的BDNF能显著提高卵母细胞的成熟率(59.07%vs48.96%,P<0.05)及随后IVF早期胚胎的囊胚率(23.29% vs 15.58%,P<0.05),但对裸卵成熟无显著影响(50.82% vs 50.86%,P>0.05)；在体外成熟液中分别添加TrkB和p75的抑制剂K-252a与Pep-5, BDNF+K-252a组的成熟率显著低于BDNF组(49.50% vs 60.01%,P<0.05),而BDNF+Pep5组的成熟率与BDNF组相比无显著性差异(59.04% vs 60.01%,P>0.05)；卵丘细胞凋亡相关基因(Bax> Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Fas、p53)、BDNF受体(TrkB、p75)及发育相关基因(CCNB1、COX2、Cx37、Cx43、CYP11A1、FSHR、HAS2、MAPK、PCNA、PGES、PTX3、TSG-6)表达的qRT-PCR检测结果显示,BDNF能显著下调Caspase-9、Fas的表达,上调TrkB、 CCNB1、PCNA、Cx37、Cx43、HAS2、PTX3、TSG-6的表达。以上结果表明：(1)克隆获得的水牛BDNF基因全长800bp,编码区753bp,编码250个氨基酸,在物种间具有高度保守性,且BDNF及其受体TrkB在水牛卵巢中高表达；(2) BDNF在水牛卵泡发育各时期及不同直径卵泡的卵泡液中均有表达,同时BDNF及p75在不同直径的卵泡颗粒细胞、体外成熟过程中的卵母细胞和卵丘细胞、以及早期发育阶段的胚胎中均有表达,而TrkB仅在颗粒细胞和卵丘细胞中高表达,在卵母细胞及早期胚胎中不表达；(3)适宜浓度的BDNF (lOng/ml)有利于水牛卵母细胞体外成：熟及发育潜能的获得,BDNF的这一作用可能是通过与卵丘细胞上受体TrkB结合,下调卵丘细胞凋亡相关基因Caspase-9、Fas的表达,上调受体TrkB、增殖相关基因CCNB1、PCNA和缝隙连接基因Cx37、Cx43,以及卵丘扩展相关基因HAS2、PTX3、TSG-6的表达而实现的。