抗生素的广泛使用对细菌遗传物质的突变诱发作用和对耐药型菌株的选择作用,导致了多重耐药细菌的广泛传播,对公共健康卫生埋下了巨大的隐患,因此现在急需开发新型的抗菌药物。抗菌肽作为一种具有免疫功能的内源性多肽,在生物发育和免疫过程中发挥着重要作用,同时抗菌肽不易产生耐药性、分子量小、广谱抗菌等优点让其成为了最具开发潜力的抗生素替代药物之一。昆虫生活在各种被病原微生物包围的环境中,具有非常强大的先天免疫系统,昆虫抗菌肽是先天免疫的重要成员,在昆虫抵御病原微生物的过程中发挥了重要作用。九香虫Coridius chinensis是半翅目(Hemiptera)中的一种药食两用昆虫。此前的研究表明该目昆虫体内具有丰富的抗菌肽,从九香虫体内分离的多肽及血淋巴具有较好的抗菌抗癌细胞活性。本研究选取九香虫为材料,基于九香虫转录组数据库克隆获得九香虫防卫素Cc Def2基因,对Cc Def2基因在九香虫体内的表达模式、Cc Def2成熟肽的结构特征及抗菌活性进行研究,为九香虫防卫素的生理功能研究和开发利用奠定基础。获得了以下结果:1.九香虫防卫素基因Cc Def2的克隆及生物信息学分析本研究基于九香虫转录组数据,运用相关生物信息学手段和防卫素结构特征筛选到九香虫防卫素基因Cc Def2,运用RT-PCR技术克隆验证获得其c DNA序列,其ORF为351 bp,编码116个氨基酸(aa),成熟肽段具43 aa,具有昆虫防卫素家族的分子结构特征,其分子量为4.70 k Da,理论等电点为9.10,为带有5个净正电荷的亲水性阳离子多肽;含有6个保守的半胱氨酸残基,形成3对二硫键,与1个α-螺旋,2个β-折叠片形成CSαβ-motif的高级结构。聚类分析研究表明,Cc Def2与红尾碧蝽防卫素的亲缘关系最近,两者的氨基酸序列相似性高达74.42%。2.九香虫防卫素基因Cc Def2的表达模式解析通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-q PCR)检测了九香虫防卫素Cc Def2基因的表达模式,结果显示:Cc Def2基因在九香虫的各个发育时期均有表达,且在5龄若虫的表达量显著高于卵、1-4龄若虫和成虫的表达量;对不同组织部位表达模式分析表明:Cc Def2基因表达量最高的组织为脂肪体,血淋巴次之,其它组织内的表达水平都相对较低。用细菌注射诱导九香虫成虫,Cc Def2基因的表达水平上调至12 h时达到最高水平,而后缓慢下调趋向于诱导前的水平。3.九香虫防卫素Cc Def2合成肽的抗菌活性抗菌活性检测结果表明,九香虫防卫素Cc Def2合成肽对金黄色葡萄球菌具有较佳的抗菌活性,对其余所检测的革兰氏菌均无抗菌活性,在浓度为40μg/m L时便能显著抑制金黄色葡萄球菌的生长,在浓度为80μg/m L时能杀灭金黄色葡萄球菌。九香虫防卫素Cc Def2合成肽对温度和p H都具有良好的耐受性,温度处理区间为-20-40℃及p H处理区间为3-10时仍能保持原有的抗菌活性。对离子强度比较敏感,当Na Cl浓度为10%时,细菌存活率为90.20%,Cc Def2多肽丧失了对金黄色葡萄球菌绝大部分抗菌活性。4.重组表达载体的构建及鉴定对设计的防卫素Cc Def2核苷酸序列进行优化,根据毕赤酵母密码子偏好性,用同义密码子代替稀有密码子,将GC含量由51.38%减少至46.25%,优化后基因的密码子适应指数(Codon adaptation index,CAI)由0.71增加到0.90,基于宿主有机体的低频率密码子的百分比(<30%)由2%降低至0%。将优化后用Xho I和Xba I分别对p MD18-T-Cc Def2和p PICZαA进行双酶切后,通过T4 DNA连接酶将具有互补粘性末端的目的片段和载体骨架连接,挑取阳性克隆经菌落PCR,双酶切及测序三步验证,成功构建了重组表达载体p PICZαA-Cc Def2。5.重组质粒在毕赤酵母中的分泌表达及抗菌活性测定为了实现Cc Def2的外源表达,用限制性内切酶Sac I将重组质粒线性化和磷酸化后,将线性化的重组质粒电转化到毕赤酵母感受态细胞GS115中,使重组质粒整合至毕赤酵母基因组中,通过抗生素筛选、Mut~+表型筛选、菌液PCR验证及基因组PCR产物测序验证筛选到阳性重组菌株GS115/p PICZαA-Cc Def2。将阳性重组菌株进行0.5%甲醇诱导,表达产物浓缩后经Tricine-SDS-PAGE检测,在发酵72 h和96 h的发酵上清中发现了约5.5 k Da左右的特异条带。浓缩的表达产物对所检测的5种革兰氏阳性菌都具有不同程度的抑菌活性,其中对金黄色葡萄球菌的抗菌活性最佳,但对3种革兰氏阴性菌都无抗菌活性。