论文部分内容阅读
背景慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）已成为全球性的公共卫生问题,心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）是其最常见并发症和最主要死亡原因,而血管钙化（vascular calcification,VC）是CKD患者心血管事件发生率和死亡率增加的直接危险因素。高磷血症是引起CKD患者血管钙化众多因素中的始动因素。糖酵解是细胞内葡萄糖在无氧或缺氧条件下,产生少量ATP,最终被分解为乳酸的过程。糖酵解途径变化在肾间质纤维化过程及肿瘤进展过程中均起到重要作用。而糖酵解在血管钙化进程的变化和作用鲜有文献报道。本研究旨在观察糖酵解途径在高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化中的变化,探讨糖酵解途径对血管钙化的影响,为血管钙化的防治提供可能的理论依据。第一部分糖酵解途径在高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化中的变化及作用目的1.观察高磷诱导的小鼠主动脉血管平滑肌细胞钙化模型中糖酵解相关基因表达及糖酵解产物乳酸变化;2.使用不同浓度的糖酵解抑制剂,探讨糖酵解途径对血管平滑肌细胞钙化的影响;方法以3 mM无机磷处理小鼠主动脉血管平滑肌细胞（MOVAS）,建立高磷诱导的钙化模型。在高磷刺激MOVAS 3d、7d时,通过茜素红S染色、钙含量测定及检测碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性确定MOVAS钙化。采用real-time PCR和Western blotting等方法检测糖酵解相关基因m RNAALDOA、m RNA PGK1、m RNA TPI1和相应蛋白的表达及糖酵解产物乳酸含量的变化。分别使用不同浓度的糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose,2-DG）（分别为0.5m M,1 m M,2 m M,4 m M,8 m M）处理高磷诱导3d、7d的MOVAS,通过茜素红S染色、钙含量测定及检测ALP活性确定MOVAS钙化的改变。采用real-time PCR和Western blotting等方法检测糖酵解相关基因m RNAALDOA、m RNA PGK1、m RNA TPI1和相应蛋白的表达及糖酵解产物乳酸含量的变化。结果1.茜素红S染色结果示:与正常对照组相比,高磷刺激3天、7天组出现明显的橘红色钙盐沉积,且7天组较3天组明显;钙含量测定结果显示:与正常对照组相比,高磷刺激3天、7天组钙含量增加,且7天组较3天组增加明显（P＜0.05）;ALP活性检测结果示:与正常对照组相比,高磷刺激3天、7天组ALP活性升高,且7天组较3天组升高明显（P＜0.05）。2.与正常对照组相比,高磷刺激3天、7天组糖酵解酶ALDOA、PGK1、TPI1m RNA及蛋白表达升高（P＜0.05）,乳酸含量升高（P＜0.05）。3.使用不同浓度的糖酵解抑制剂2-DG（分别为0.5 m M,1 m M,2 m M,4 m M,8m M）处理高磷诱导3d、7d的MOVAS,茜素红S染色发现,随着2-DG浓度的增加,MOVAS钙盐沉积程度逐渐减轻,钙含量降低,ALP活性降低（P＜0.05）。但过高的2-DG可能抑制MOVAS的生长,并且使细胞形态发生改变。第二部分糖酵解途径在人动静脉内瘘处血管中的变化目的观察终末期肾脏病血液透析患者动静脉内瘘处血管中糖酵解酶相关基因表达变化,分析糖酵解在血液透析患者血管钙化的作用。方法选取2020年07月-2020年12月在河南省人民医院行“自体动静脉瘘血管瘤切除术”的终末期肾脏病血液透析患者作为实验组（experimental group,EG组）,收集一般信息、临床资料及术中废弃的动静脉内瘘处血管组织;同时,选取2020年07月-2020年12月在河南省人民医院行“冠状动脉旁路移植术”患者作为对照组（control group,CG组）,收集其一般信息、临床资料、及手术所用的大隐静脉及胸廓内动脉血管组织,分析其临床指标差异。将收集的血管环一部分制备成石蜡切片,使用茜素红S染色法测定血管是否钙化及钙化程度;使用免疫组化法检测ALDOA、PGK1、TPI1在血管组织表达量;应用Western blotting方法检测CKD患者钙化的血管中ALDOA、PGK1、TPI1的蛋白表达。结果1.EG组纳入患者15例,CG组纳入5例,两组间年龄及性别构成比无统计学差异。临床指标中,EG组血肌酐、血磷、甲状旁腺激素、血清碱性磷酸酶较CG组有显著升高（P＜0.05）;EG组血红蛋白较CG组显著降低（P＜0.05）。2.糖酵解途径在人动静脉内瘘血管中的变化情况与CG组相比,EG组发生明显钙化,且其中糖酵解相关基因ALDOA、PGK1、TPI1蛋白表达明显升高（P＜0.05）。结论1.在高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化模型及终末期肾脏病血液透析患者动静脉内瘘处血管中,糖酵解途径表达升高。2.抑制钙化血管平滑肌细胞中的糖酵解,可减轻血管平滑肌细胞的钙化程度,但过高浓度2-DG能显著抑制血管平滑肌细胞的增殖,使细胞形态发生明显改变。